[發明專利]一種百合種球病毒的檢測方法

有效

• 申請號: 200910091971.0
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101649355A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 呂英民;鄭麗娜;程堂仁;張強英;張啟翔
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

1.一種百合種球病毒的檢測方法，其包括如下步驟：

I提取百合種球鱗片RNA，提取方法是：采用改進的Trizol和 CTAB法提取百合種球鱗片RNA，其中改進的Trizol法包括步驟：

(1)取-70℃保存的鱗莖內側鱗片0.1～0.5g，在經0.1％DEPC的無 菌水處理、干熱滅菌后的研缽中加液氮充分研磨；

(2)加入1mLTrizol提取液，室溫放置5min，使其充分裂解，磨至 勻漿，12,000rpm離心15min，棄沉淀，收集提取液于離心管；

(3)加入0.2mL三氯甲烷并上下倒置混勻，12,000rpm，4℃離心 20min；

(4)小心收集上清，轉移至新離心管中，加入與上清等體積的異 丙醇，充分混勻，室溫靜置10min；

(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，RNA沉于管底；

(6)重復步驟(3)-步驟(5)3次；

(7)加入由DEPC水配制的1mL?75％乙醇，洗滌沉淀，4℃， 7500rpm，離心10min，棄上清；

(8)沉淀干燥后，溶于20mlLRNA溶解液或DEPC水中，置于-70℃ 冰箱備用；或

改進的CTAB法包括步驟：

(1)將-70℃保存的鱗片樣品0.1g，在經0.1％DEPC的無菌水處理、 干熱滅菌后的研缽中加液氮充分研磨至粉末；

(2)迅速轉入1.5mL離心管中，加入600μL?65℃預熱的CTAB 提取液，其含有2％CTAB，2％PVP，100mM?pH8.0TrisCl，10mM NaCl，25mM?pH8.0EDTA，使用前加入2％β-巰基乙醇，蓋緊蓋子， 立即劇烈渦旋振蕩30s，使粉末完全分散在溶液中；

(3)65℃溫浴25～30min，期間劇烈渦旋振蕩3～5次，然后冷卻至 室溫；

(4)向上述混合液中加入等體積的氯仿/異戊醇抽提三次，每次 渦旋振蕩5min后，室溫或18℃下12,000rpm離心15min，轉移上清至 新的離心管中；

(5)加入1/4體積10M?LiCl，混勻，4℃過夜沉淀；

(6)4℃，10,000rpm離心20min收集沉淀，用500μL?SSTE，其含 有1.0M?NaCl，0.5％SDS，10mM?TrisCl，1mM?EDTA，緩沖液溶解 沉淀，加入等體積的氯仿/異戊醇再抽提1～2次；

(7)轉移上清后加入2倍體積無水乙醇，-20℃放置2h或-70℃放 置30min；

(8)4℃，12,000rpm離心20min，沉淀RNA，先后用500μL75％乙 醇、500μL無水乙醇漂洗沉淀，超靜臺上吹干后，用30μL?RNase-free dd?H₂O溶解，置于-70℃冰箱備用；

II?RT-MPCR：將步驟I中得到的RNA反轉錄后，用以下引物擴 增反轉錄產物，并進行電泳檢測；

CMV上游引物：GAAACCAGATGGACAATCT，CMV下游引物： ATCATACAACCATAAGCGCCGA；

LMoV上游引物：CAAGACATGCAATCAGCACA，LMoV下游引 物：CCCTATCTCATCCATTATTT；以及

LSV上游引物：CACCTCACCAAAAAATGGTGT，LSV下游引 物：TAGTTCCAAGTAAGGAGA。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟II?RT-MPCR 體系包括RT反應和PCR反應，其中RT反應操作步驟如下：

(1)在冰浴的試管中加入如下反應混合物：模板總RNA1μg/μL?5μg； Oligo(dT)180.5μg/μl?1μL；RNase-free?ddH₂O?6μL；

(2)輕輕混勻后，在70℃水浴5min后，冰浴5min；

(3)向冰浴的試管中加入如下組分：5×Reaction?Buffer?4μL； RNase?Inhibitor?40U/μl?1μL；dNTP?Mix?10mmol/L?1μL；

(4)輕輕混勻后離心3～5sec，加入2μl?M-MLV?RT?200U/μL，終體 積為20μL；

(5)反應混合物先在25℃溫育10min，然后37℃水浴60min；

(6)在70℃加熱10min結束反應，合成cDNA第一鏈，置冰上進行 后續實驗或冷凍保存；

PCR反應體系為：

PCR反應程序：95℃預變性4min，然后94℃變性20sec，52℃退火 30sec，72℃延伸3min，35個循環，72℃延伸5min，最后于4℃結束。