[發(fā)明專利]一種百合種球病毒的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910091971.0
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101649355A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發(fā)明（設計）人: 呂英民;鄭麗娜;程堂仁;張強英;張啟翔
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發(fā)明涉及一種百合種球病毒的檢測方法，特別涉及一種百合種 球病毒CMV、LSV及LMoV的檢測方法。

背景技術

多元RT-PCR技術(RT-MPCR)在百合方面的應用：王繼華等(王 繼華.應用多重PCR方法檢測百合無癥病毒和斑駁病毒[J].園藝學報， 2005，32(2)：254～287)應用二重PCR技術檢測了LSV和LMoV病毒， 黎昊雁等(黎昊雁，吳姍，張曉峰，方瑩，施偉良.復合RT-PCR方 法同步檢測百合X病毒、百合無癥病毒及百合斑駁病毒.植物保 護，32(6)，2006，42～45)采用復合RT-PCR檢測了LXV、LSV及LMoV， 但是二者都沒有檢測CMV，而CMV病毒是侵染百合的三大主要病毒 之一，危害嚴重，發(fā)病廣泛，有待檢測。

徐榕雪(徐榕雪.百合主要病毒的分子檢測及脫毒技術研究.南京 林業(yè)大學，2007)檢測了栽培品種及野生種葉片，花的病毒，其葉、 花、鱗片采用了一種試劑盒提取，其鱗莖總RNA的提取質(zhì)量不高，沒 有針對百合種球建立RNA提取方法，而百合鱗莖組織中富含多糖，多 酚等次生代謝物，這些組織的許多理化性質(zhì)與RNA相似，從而在沉 淀RNA時，往往產(chǎn)生富含多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA 沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，在去除多糖的同時RNA 也容易被帶走，造成RNA得率的減少，因此從種球中提取高質(zhì)量的 RNA有相當?shù)碾y度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定快速，可重復性好，成本低廉，可 用于百合種球CMV、LSV及LMoV的病毒檢測方法。

本發(fā)明的目的是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的 一種百合種球病毒的多重檢測引物，包括：

CMV上游引物：GAAACCAGATGGACAATCT，CMV下游引物： ATCATACAACCATAAGCGCCGA；

LMoV上游引物：CAAGACATGCAATCAGCACA，LMoV下游 引物：CCCTATCTCATCCATTATTT；以及

LSV上游引物：CACCTCACCAAAAAATGGTGT，LSV下游引 物：TAGTTCCAAGTAAGGAGA。

本發(fā)明還提供含有前述所述檢測引物的檢測試劑盒。

本發(fā)明還提供含有前述檢測引物或檢測試劑盒在檢測百合種球 病毒中的應用。

本發(fā)明還提供一種百合種球病毒的檢測方法，其包括如下步驟：

1)提取百合種球鱗片RNA；2)RT-MPCR：將步驟1)中得到的RNA 反轉錄后，用前述引物擴增反轉錄產(chǎn)物，并進行電泳檢測。

前述的檢測方法，其中所述步驟1)提取RNA的方法是：采用改 進的Trizol和CTAB法提取百合種球鱗片RNA，其中改進的Trizol法包 括步驟：(1)取-70℃保存的鱗莖內(nèi)側鱗片0.1～0.5g，在經(jīng)0.1％DEPC 的無菌水處理、干熱滅菌后的研缽中加液氮充分研磨；(2)加入 lmLTrizol提取液，室溫放置5min，使其充分裂解，磨至勻漿，12,000rpm 離心15min，棄沉淀，收集提取液于離心管；(3)加入0.2mL三氯甲烷并 上下倒置混勻，12,000rpm，4℃離心20min；(4)小心收集上清，轉移 至新離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置 10min；(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，RNA沉于管底；(6) 重復步驟(3)-步驟(5)3次；(7)加入1mL75％乙醇(DEPC水配制)洗滌沉 淀，4℃，7500rpm，離心10min，棄上清；(8)沉淀干燥后，溶于 20mlLRNA溶解液或DEPC水中，置于-70℃冰箱備用；或