[發明專利]禽流感合成肽疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 200910091463.2
• 申請日: 2009-08-21
• 公開（公告）號: CN101628932A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 齊鵬;郭麗清;肖進;李丙首;巴利民;宋芳
• 申請（專利權）人: 中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/11
• 分類號: C07K14/11;A61K39/145;A61P31/16;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司
• 代理人: 曹津燕

技術領域

本發明涉及一種用于禽流感合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及 含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。

背景技術

禽流感(Avian?influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian?influenza?virus， AIV)引起的多種禽類感染的傳染病，被國際獸醫局(OIE)列為A類傳染病， 也被我國列為一類動物疾病。AIV是屬于正粘病毒科流感病毒屬的A型流感 病毒，其基因組是由8個分節段的單股負鏈RNA組成，分別編碼8種不同功能 的蛋白：多聚酶蛋白PB1、PB2、PA；血凝素蛋白HA；核衣殼蛋白NP；神 經氨酸酶蛋白NA；基質蛋白M1和M2，以及非結構蛋白NS1和NS2，其中， 血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)和M2蛋白為禽流感病毒的三種表面抗原 分子，針對這三種抗原的抗體都有抑制流感病毒感染的作用。

禽流感滅活疫苗的保護效力具有亞型特異性，而禽對已知的15種HA亞 型都易感，且人們無法預測什么時候家禽會感染哪種亞型，一次使用預防性 疫苗來阻止所有可能的亞型禽流感的發生是不現實的。此外，HA和NA抗原 性變異頻率很高，不同變異株不產生交叉保護，研制此類抗原疫苗的速度往 往跟不上病毒變異，這就是目前我國雖不斷使用疫苗，但禽流感卻不斷爆發 的原因所在。

為此，禽病科學家一直致力于研究其他類型的疫苗，如DNA疫苗，現已 誕生了由桿狀病毒表達的禽流感病毒H5N1的HA基因制成的亞單位疫苗；表 達HA或NA基因的重組雞痘病毒活載體疫苗。這些疫苗的一個突出優點就是 只使用了禽流感病毒的某一種或某二種抗原成分，這樣有利于開發針對性地 檢測方法對疫情進行監測。但是，這些疫苗同樣無法提供抵抗各種亞型的禽 流感的交叉保護作用。因此，開發新型的廣泛性防治禽流感病毒感染的技術 成為科學工作者的研究熱點。

利用A型禽流感病毒M2蛋白是研究具有交叉保護性疫苗的一個重要方 向，相關研究如下：Watanabe?T等利用缺失M2跨膜區的流感病毒制成了活疫 苗；Slepushkin?VA等和Frace，M.等的研究表明基因工程表達的M2免疫之后， 能夠保護小鼠抵御不同亞型流感病毒的攻擊；Neirynck(1999)等將A型流 感病毒的保守的M2蛋白胞外區與乙肝病毒核心蛋白融合，試圖產生一個針 對流感病毒的通用疫苗，他們發現對小鼠進行腹腔注射或鼻內施用，可使 99-100％的小鼠產生對致病性流感病毒X47攻擊免疫力；Mozdzanowska?K等 (2003)將M2的胞外區和輔助性T細胞的決定簇經肽鏈連接后，構建帶有佐 劑作用的M2e-MAPS復合物，免疫小鼠后獲得了很強的保護力和明顯的抑制 病毒在呼吸道中復制的能力。這些研究結果說明，M2蛋白在機體內不僅能 刺激產生抗體，而且能引起細胞毒性T細胞(CTL)反應。因此，以M2作為抗 原，可對不同亞型的禽流感病毒產生保護性免疫，是研究交叉保護性流感疫 苗的理想候選抗原。

跨膜蛋白M2是除HA、NA外的第3種跨膜蛋白，含有97個氨基酸，分子 質量約為15ku。它的編碼基因位于AIV基因組的第7個節段上，并由它的第2 個小mRNA翻譯。M2蛋白不含糖基，具有高度保守性。感染細胞的細胞膜上 的A型禽流感病毒的M2蛋白與I類糖蛋白相似，即氨基端在細胞外，羧基端 在細胞內。細胞外部分有24個氨基酸(M2e)，跨膜區是由19個氨基酸組成 的疏水區，羧基端的54個氨基酸位于細胞膜內。M2蛋白是A型禽流感病毒的 一個高度保守性的跨膜蛋白(同源性達90％)，特別是氨基端的10個氨基酸是 非常保守的，在所測得的禽流感和人流感病毒中，其序列幾乎完全相同。

由于氨基末端的24個氨基酸殘基的保守性極高，用這24個氨基酸殘基 作為表位所表達的融合蛋白可表現出很好的免疫保護性。Neirynck?S等人將 M2蛋白保守性位點基因與乙肝病毒核心蛋白進行融合，制得表達質粒，對 小鼠進行腹腔注射或鼻內施用接種。試驗顯示這幾種質粒都可誘導機體產生 對不同毒株攻擊的保護作用，既抑制了病毒的生長繁殖，又降低了動物的死 亡率。