[發明專利]DNA分子片段與載體連接的方法及在大容量抗體庫構建中的應用

有效

• 申請號: 200910091261.8
• 申請日: 2009-08-14
• 公開（公告）號: CN101619323A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 孫志偉;王雙;俞煒源;杜威世;余云舟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C40B40/08
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及一種DNA分子片段與載體連接的方法及其在大容量抗體庫構建中的應用。

背景技術

DNA分子連接一直是重組質粒構建過程的關鍵環節，由于連接效率的限制，使得一些重組克隆的獲得較為困難，尤其在構建各類DNA分子庫的過程中，連接效率尤為重要。因此，提高連接效率對于提高轉座子數量具有重要意義，尤其是在通過基因工程手段構建包括抗體、多肽和各種其他蛋白質文庫的過程中具有重要意義。

近年來，利用噬菌體抗體庫技術制備各種診斷和治療性抗體已經成為目前基因工程抗體領域一個重要的技術手段，而其基礎依賴于各種類型的大容量抗體庫資源的存在。抗體庫庫容量和質量是決定是否能夠獲得高親和力目標抗體的關鍵。近年來，國外已經利用各種優化的技術構建了一些大容量抗體庫，并從中獲得了許多有開發前景的抗體分子，目前已經有多株抗體進入臨床實驗。其中有代表性的大容量抗體庫主要是AG公司的HuCAL庫和CAT公司的抗體庫，這兩個抗體庫的庫容量均已經超過了10¹⁰，并且目前仍在繼續擴建，利用這兩個抗體庫目前已經制備出多種治療性抗體進入臨床前和臨床研究階段。從技術上講，制約大容量抗體庫構建的關鍵因素主要是連接和轉化的效率。高效的連接和轉化技術是構建大容量抗體庫的前提和保證。Sheet等人^[1]從PCR條件、克隆用酶切位點的選擇、載體特點等方面進行條件的優化，以提高連接的效率，并通過多次電轉化使庫容量達到6.7×10⁹。也有人對抗體基因克隆的方法進行改進，采用兩步克隆甚至三步克隆法來實現大容量抗體庫的構建^[2]。電擊轉化是目前最高效的轉化方式，經過多次電轉化積累庫容量是實現大容量的必要途徑。而對于單次電擊轉化而言，感受態細胞的質量、連接產物的大小與質量、連接產物的濃度及電擊緩沖液的組成等都是影響轉化效率的重要因素。連接效率不僅決定了正確連接產物的比例，同時連接產物的質量還直接影響電擊轉化的效率，提高連接效率和連接產物的質量將極大提高轉化的效率，減少轉化的次數。普通的連接不僅效率低，而且連接產物成分復雜，其中的非正確連接的載體和片段將對電擊轉化效果造成干擾。以一個普通的雙酶切連接為例，連接體系最終的連接產物包括以下幾種形式：載體二聚體和多聚體、片段二聚體和多聚體、載體和片段線性連接體及正確的載體與片段環狀重組載體。因此，普通連接產物不論是正確連接產物的比例還是在成分的復雜程度上都很難達到高效電擊轉化的要求。

也有研究通過首先構建初級庫進而對其通過重組技術進行擴建的例子，利用這種方法構建抗體庫可以繞過大量電擊轉化的瓶頸，通過不同抗體分子間輕重鏈重組的方法實現抗體多樣性的增加，例如，Sblattero^[3]等人利用Cre-loxp重組的方法構建了庫容量達10¹¹以上的大容量抗體庫。然而，由于這種方法所構建的抗體庫僅僅是通過輕重鏈互換的方法擴大庫容量，而在CDR區的多樣性上存在不足，因此具有一定的缺陷。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效的DNA分子片段與載體連接的方法及其在大容量抗體庫構建中的應用。

連接和轉化是構建包括抗體和多肽在內的各種大容量蛋白質文庫的過程中一個限制性的技術。最終所獲得的庫容量的大小直接取決于通過轉化所獲得的轉座子的數目。而其中連接產物的質量和正確連接產物的數量是影響轉化效率進而影響庫容量的關鍵。高效連接影響因素涉及載體的性質、限制性內切酶的酶切與回復連接的效率、載體與目的基因的比例、連接體系的濃度等因素。從DNA分子角度上講，雙酶切連接過程實際上可以分解為兩個過程，首先是DNA分子兩片段之間的單酶切位點連接，形成線性連接產物，這一過程可認為是分子間連接，其次是線性連接產物的分子內連接，即線性連接產物的自身環化過程。而分子間和分子內連接的最佳的實驗條件不同，對于分子間連接而言，一方面需要增加分子間碰撞的機會，另一方面需要降低同片段間自連的比例；對于分子內連接而言，則需要降低分子間碰撞接觸的機會，同時增加分子內自連接的比例。普通雙酶切連接無論如何優化條件都無法將兩個過程分開實現每一步的連接條件的最優化處理，因此連接效率一般很低，最高只有百分之十幾。因此，設計將兩步連接過程分開進行，可實現每一步連接的最優化處理，從而可以提高總體連接效率。