[發(fā)明專利]DNA分子片段與載體連接的方法及在大容量抗體庫(kù)構(gòu)建中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910091261.8
• 申請(qǐng)日: 2009-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN101619323A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫志偉;王雙;俞煒源;杜威世;余云舟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C40B40/08
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

1.一種DNA分子片段與載體連接的方法，其特征在于，載體上包括至少三個(gè)不同的酶切位點(diǎn)E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之間；待連接的DNA分子片段至少包括酶切位點(diǎn)E1和E3，先對(duì)載體上酶切位點(diǎn)E1和E2進(jìn)行酶切和去磷酸化；再對(duì)DNA分子片段的酶切位點(diǎn)E1進(jìn)行第一步酶切和連接，得到DNA分子片段和載體的線性連接產(chǎn)物，然后回收正確大小的連接產(chǎn)物；最后對(duì)連接產(chǎn)物的酶切位點(diǎn)E3進(jìn)行第二步酶切和連接，得到自連接的環(huán)狀連接產(chǎn)物。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點(diǎn)E1選自Sfi?I、Not?I、EcoR?I、Hind?III、BamH?I、AlwN?I、Bsa?I、BseY?I、Dra?III或Ear?I酶切位點(diǎn)中的一種。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點(diǎn)E2選自Sfi?I、Not?I、EcoR?I、Hind?III、BamH?I、AlwN?I、Bsa?I、BseY?I、Dra?III或Ear?I酶切位點(diǎn)中的一種。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點(diǎn)E3選自Sfi?I、Not?I、EcoR?I、Hind?III、BamH?I、AlwN?I、Bsa?I、BseY?I、Dra?III或Ear?I酶切位點(diǎn)中的一種。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切位點(diǎn)E3為具有非反向回文結(jié)構(gòu)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，選自Sfi?I、AlwN?I、Bsa?I、BseY?I、Dra?III或Ear?I中的一種。

6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，第一步連接體系中DNA的濃度控制在30-40ng/μL，第二步連接的DNA濃度控制在1.5-2.5ng/μL。

7.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述第一步連接之后還包括通過(guò)PCR的方法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行一定量的擴(kuò)增。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在所述第一步連接之后還包括通過(guò)PCR的方法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行一定量的擴(kuò)增。

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR采用保真度高的DNA聚合酶，同時(shí)將PCR的循環(huán)數(shù)控制在15個(gè)循環(huán)以內(nèi)。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR采用保真度高的DNA聚合酶，同時(shí)將PCR的循環(huán)數(shù)控制在15個(gè)循環(huán)以內(nèi)。

11.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)或8或9或10所述的方法在構(gòu)建抗體庫(kù)、肽庫(kù)和其他蛋白及cDNA文庫(kù)中的應(yīng)用。

12.權(quán)利要求6所述的方法在構(gòu)建抗體庫(kù)、肽庫(kù)和其他蛋白及cDNA文庫(kù)中的應(yīng)用。

13.權(quán)利要求7所述的方法在構(gòu)建抗體庫(kù)、肽庫(kù)和其他蛋白及cDNA文庫(kù)中的應(yīng)用。