[發明專利]3α-羥基類固醇脫氫酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒

有效

• 申請號: 200910090688.6
• 申請日: 2009-09-08
• 公開（公告）號: CN101698834A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12Q1/32;C12Q1/68;C12R1/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

技術領域

本發明涉及一種酶，編碼該酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組 載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述酶、核苷酸序列、重 組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。更具體地，本發明涉及一種3 α-羥基類固醇脫氫酶，編碼該3α-羥基類固醇脫氫酶的核苷酸序列，包括所 述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述 3α-羥基類固醇脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種 的試劑盒。

背景技術

3α-羥基類固醇脫氫酶(3α-Hydroxysteroid?Dehydrogenase，3α-HSD，EC 1.1.1.50)可作用于多種底物，可逆性地催化C19-27類固醇3位羥基/酮基的氧 化還原。膽汁酸是3α-HSD的作用底物之一，臨床上用3α-HSD作為工具酶 來測定人血清中的總膽汁酸(total?bile?acids，TBA)濃度。因而可以制備成包 括3α-羥基類固醇脫氫酶的相應試劑盒，例如檢測血清中膽汁酸濃度的試劑 盒。

膽汁酸與3α-HSD及氧化型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+) 發生反應，生成3-酮膽汁酸和還原型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Thio-NADH)。3-酮膽汁酸在3α-HSD和NADH作用下，還原生成膽汁酸 及NAD+。例如，具體反應原理可以如以下的式一所示：

(式一)

由以上反應式可知，Thio-NADH的生成速率與被測樣本中膽汁酸濃度成 正比，因此可以利用分光光度計，通過在405nm波長處監測Thio-NADH引 起的吸光度的變化來計算出被測標本(例如，血清等體液)中的膽汁酸濃度。 此外，還可以利用分光光度計，通過在340nm波長處監測NADH吸光度的變 化，來計算出3α-HSD的酶活性。

現已經開發出符合以上原理的測定血清中膽汁酸濃度的試劑盒，例如旭化 成株式會社(Asahikasei)生產的血清膽汁酸濃度的檢測試劑盒。

但是目前的試劑盒所用的3α-羥基類固醇脫氫酶存在著耐熱性差(參見圖 3)，使試劑盒的運輸、保存和使用過程對環境溫度要求較高，容易由于3α- 羥基類固醇脫氫酶的變性而影響到試劑盒測定的有效性和準確性。

發明內容

本發明的一個目的是克服現有的3α-羥基類固醇脫氫酶耐熱性差的缺點， 提供一種耐熱性好的3α-羥基類固醇脫氫酶。

本發明的第二個目的是提供編碼所述3α-羥基類固醇脫氫酶的核苷酸序 列。

本發明的第三個目的是提供包括所述核苷酸序列的重組載體。

本發明的第四個目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細胞。

本發明的第五個目的是提供包括上述3α-羥基類固醇脫氫酶、核苷酸序 列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。

3α-羥基類固醇脫氫酶廣泛存在于多種生物體中，但是不同種生物體(比 如多種細菌等)來源的3α-羥基類固醇脫氫酶的性質差別很大。本發明的發明 人付出了大量地創造性勞動，利用對多種生物體設計引物調取目的基因并結合 定點突變技術的方法，最終通過從惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida ATCC12633)中調取3α-羥基類固醇脫氫酶編碼基因并對之進行隨機定點突 變，得到本發明具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列的3α-羥基類固醇脫氫 酶。并且本發明的發明人意外地發現，所得3α-羥基類固醇脫氫酶耐熱性好， 從而降低了對由其制備的試劑盒的運輸、保存的溫度條件。其中所述惡臭假單 胞菌購自美國標準生物品收藏中心，其編號為ATCC12633。

本發明提供了一種3α-羥基類固醇脫氫酶，其中，所述3α-羥基類固醇 脫氫酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。

本發明還提供了編碼本發明所述3α-羥基類固醇脫氫酶的核苷酸序列。

本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。

本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。

本發明還提供了包括本發明所述的3α-羥基類固醇脫氫酶、核苷酸序列、 重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。