[發明專利]提取純化DNA的試劑

有效

• 申請號: 200910090335.6
• 申請日: 2009-08-05
• 公開（公告）號: CN101613696A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 趙興春;葉健;姜伯瑋
• 申請（專利權）人: 公安部物證鑒定中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種提取純化DNA的試劑。

背景技術

DNA分離純化是分子生物學實驗中非常重要的操作，核酸的質量直接關系到后續操作能否順利進行。生物學、法醫學和基因組學的發展，強化了對從各種生物檢材中獲得核酸的復雜方法的需求。例如，脫氧核糖核酸提供了廣泛的關于遺傳起源和遺傳多態性信息。這些信息可用于法醫遺傳學鑒定實踐。

目前所存在的各種核酸純化方法皆可分成以下兩大類：液相純化和固相純化。在液相純化中，核酸維持為液體狀態，而雜質通過沉淀、離心被除去或者核酸被沉淀出來，而雜質被保留；在固相純化中，核酸被結合到固相載體上，而雜質被選擇性洗脫。例如，采用液相純化來分離的DNA保留在液相中，而雜質被通過諸如沉淀和/或離心之類的方法除去。在固相純化中DNA結合到固相載體上，而雜質如RNA、蛋白質和磷脂等被選擇性洗脫。在DNA純化中，如果起始材料包括細胞，液相方法和固相方法都需要細胞或病毒共破裂，或裂解步驟。破裂或裂解步驟產生與污染物如RNA、脂質、碳水化合物、蛋白質等混合的DNA。這種混合物還含有降解DNA的必須被除去和/或滅活以不感染產生基本上未降解的DNA的DNA酶。兩個純化大類以前都利用常規的方法，需要繁瑣的步驟，且通常用到有害的試劑，現在也出現了更快速的提取方法，如Chelex-100法，僅需要較少的步驟，且通常較少的有害試劑。

Chelex-100法一種快速液相DNA純化方法，Chelex-100是一種化學整合樹脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，整合多價金屬離子，尤其是選擇性整合二價離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結合力.能結合許多可能影響一步分析的其他外源物質。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結合的物質與DNA分離，防止結合到Chelex中的抑制劑或雜質帶到PCR反應中，影響下一步的DNA分析，并通過結合金屬離子，防止DNA降解。利用螯合劑去除生物樣品中金屬雜質而達到純化的目的。該法首先用去離子水洗滌生物樣品，加入螯合樹脂的懸浮液56℃孵育一定時間，100℃孵育8分鐘，然后通過離心去除雜質。該方法簡單、快速(僅涉及到兩種試劑的使用)。但該法提取得到的DNA純度不夠，不能滿足微量DNA生物樣品DNA提取純化的要求。

固相提取方法近年來發展迅速，在核酸提取領域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個主要步驟：裂解細胞使細胞膜、核膜DNA破裂以釋放DNA；釋放的DNA與固相載體結合；雜質的洗滌；洗脫而得到純化的DNA。對于固相DNA純化，已使用了多種固相載體，如二氧化硅微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。當核酸存在于在高濃度離液鹽以及低的pH溶液中時，能夠吸附到硅類介質表面，并在低鹽高pH溶液中洗脫下來，從而達到提取純化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉從瓊脂糖凝膠中提取到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提純質粒DNA。Boom等對該方法加以改進，用二氧化硅和硅藻土為固相吸附劑，用來提取純化人血清或尿液中的微量病原體基因組DNA。該方法需要六步離心、五種試劑從全血中純化DNA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提取純化DNA的試劑。

本發明提供的提取純化DNA的試劑，由以下物質組成：

預處理裂解液：pH為7.4-8.5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：10-100mM緩沖鹽，0.5-5g/100ml的表面活性劑，1-100mM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽和0.2-4mg/ml的蛋白酶K；

裂解結合液：pH＝6.4-7.4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：20-150mM的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10％(體積百分含量)的表面活性劑，0.5-4g/100ml的兼性離子去污劑，10-100mM的螯合劑以及15-30％(體積百分含量)的醇；

洗滌液I：溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質：4-6M的Chaotropic鹽，25-50％(體積百分含量)的醇和10-100mM的螯合劑；

洗滌液II：75-80％(體積百分含量)乙醇水溶液；

洗脫液：是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是0-20mM的Tris-HCl，0-2mM的EDTA；

磁珠懸浮液：每ml磁珠懸浮液的成分如下：直徑為50-1200nm的納米級硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。