[發明專利]定量檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B的膠體金免疫層析方法以及膠體金免疫檢測試紙條

無效

• 申請號: 200910090041.3
• 申請日: 2009-07-29
• 公開（公告）號: CN101666802A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 王靜;姜永強;張曉龍;楊宇;孫肖紅;胡孔新;姚李四
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/552;G01N33/532
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及金黃色葡萄球菌毒素B的檢測快速定量檢測方法以及膠體金免疫檢測試紙條。

背景技術

金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起感染和中毒性疾病的主要病原菌，其致病性主要與其產生多種致病物質有關，葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal?en2terotoxin?B，SEB)是其中一種重要的致病物質，其小鼠LD值為0.023-5μg/kg。金黃色葡萄球菌能引起食物中毒，主要原因為其能產生腸毒素(Enterotoxin，簡稱SE)從臨床分離的金黃色葡萄球菌，約1/3產生腸毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素主是由血漿凝固酶或耐熱酸酶陽性菌株所產生的一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質，迄今從血清型上已被鑒定的SE有10種，A、B、C、D、E、G、H、I、J、K，其中C型抗原又根據等電點的不同分為3個亞型(C1、C2、C3)，各型腸毒素均能引起食物中毒，其中以A型和D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。腸毒素可引起急性胃腸炎，人吃了被產毒菌株污染了的牛奶、肉類、魚蝦、蛋類等食品就會引起食物中毒。

腸毒素是一種可溶性蛋白質，耐熱，經100℃煮沸30分鐘不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響，故誤食污染腸毒素的食物后，在腸道作用于內脂神經受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產生急性胃腸炎癥狀。發病急，病程短，恢復快。一般潛伏期為1～6小時，出現頭暈、嘔吐、腹瀉，發病1～2日可自行恢復，預后良好。

目前金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的檢測方法主要依靠傳統的分離養和生化鑒定，該方法費時費力(參見：吳清平.“單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究進展”，J.中國衛生檢驗雜志，2005，15(7)：888-890；Robin?L?T?Churchill，Hung?Lee，et?al.“Detection?of?Listeria?mono2cytogenes?and?the?toxin?listeriolysin?O?in?food”J.Journal?of?Mi2?crobiological?Methods，2006，64：141-170.)。

膠體金快速診斷試紙條技術是20世紀90年代以來發展起來的一項新型體外診斷技術(參見：Grabar?KC，Freeman?RG，Hommer?MB，et?al.“Preparation?and?characterization?of?Au?colloid”J.Anal?Chem，1995，67：735-743.)。近年來該方法發展迅速，在生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到了廣泛應用，但用于食品衛生領域檢測的產品較少。本研究針對金黃色葡萄球菌腸毒素B研制出了食品污染金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫膠體金檢測試紙條。(李小兵，謝光洪，周昌芳，等.“相思子毒素-a的純化及鑒定”.《中國獸醫學報》，2008，28(3)：310-313；李小兵，謝光洪，周昌芳等.“相思子毒素-a單克隆抗體的制備與鑒定”。《中國獸醫學報》，2008，28(7)：836-839.)

發明內容

本發明涉及膠體金免疫層析技術快速定量檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的方法及其產品。本發明的方法利用膠體金標記和雙抗體夾心免疫層析技術提供了一種金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的快速檢測方法。發明人評價其特異性和敏感性，并擬合檢測曲線進行定量檢測；在奶粉、牛奶、火腿腸等食品樣品中添加金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)模擬污染樣品，評價該方法對固體、半固體、液體等食品、可疑生物恐怖樣品的檢測能力。本發明的方法可在15min內完成定性和半定量檢測，靈敏度為1ng/ml，線性范圍10ng/ml-5000ng/ml、回收率94％^-112％。該法特異性、穩定性良好，可對樣品直接進行檢測。

本發明提供一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準確地檢測樣品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，并可實現定量，適用于現場快速檢測。

一種檢測金葡菌腸毒素B型的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入檢測試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述檢測試紙包括：

(1)反應支持物；

(2)吸水墊；

(3)硝酸纖維膜，該膜包被有金葡菌腸毒素B型抗體和質控抗體的檢測條帶和質控條帶；

(4)金標抗體墊，其中含有膠體金標記的金葡菌腸毒素B型抗體；

(5)樣品墊；