[發明專利]環介導等溫擴增技術(LAMP)檢測鼠疫桿菌的方法

無效

• 申請號: 200910090037.7
• 申請日: 2009-07-29
• 公開（公告）號: CN101665832A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 王靜;文海燕;龍冬伶;孫肖紅;楊宇;張曉龍;姚李四
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種改進的環介導等溫擴增 方法及其在檢測鼠疫桿菌中的應用。

背景技術

鼠疫是一種以發病急、傳播快、病死率高、傳染性強為特征的自 然疫源性傳染病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規定的甲類傳 染病。自從上個世紀90年代以來，全球鼠疫流行呈上升趨勢。世界 范圍鼠疫疫情連年不斷，尤以非洲為重，亞洲次之，但也有大規模的 爆發流行。與世界其它地區一樣，我國鼠疫自然疫源地進入活躍期， 鼠疫疫情也明顯上升。鼠疫的病原體鼠疫桿菌在自然界中常表現為典 型菌與非典型菌并存的狀況，非典型鼠疫菌是不具備典型鼠疫桿菌生 物學特性一項或幾項特異特征的菌株。在鼠疫流行靜息期，非典型鼠 疫桿菌是鼠疫桿菌在自然界中長期保存的主要形式，而典型菌是鼠疫 流行期的主要菌群，典型菌和非典型菌在一定情況下可發生互相轉 換。

目前對鼠疫的檢測方法有常規四步檢測法，免疫學檢測法，分子 生物學法，全自動微生物分析系統。我國對鼠疫菌的檢測主要采用血 清學方法和鼠疫菌的四步檢測法。血清學方法只能作追溯性診斷，四 步檢驗雖然可靠，但耗時過長。常規的檢測手段很容易檢出典型鼠疫 菌，卻很難檢出非典型鼠疫菌，而且靈敏度及特異性不高。PCR技術 多以存在于鼠疫菌質粒上的毒力基因為靶位點進行檢測，對非典型鼠 疫菌的調查缺乏特異性，且大多PCR擴增方法均局限在室內，不適 用于疫源地的監測與現場初篩。

發明內容

本發明涉及一種新的檢測鼠疫桿菌的非診斷性方法，其中采用環 介導等溫擴增技術。

環介導等溫擴增技術(LAMP)是日本學者Notomi發明的一種 全新核酸擴增方法，它在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增強 了反應的特異性和縮短了反應時間，而且不需要昂貴的熱循環儀，等 溫條件下即可完成反應，擴增產物肉眼可見，便于推廣應用。

LAMP是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚 合酶，在恒溫條件下特異，高效，快速擴增DNA的新技術。LAMP 反應主要包括兩個階段：循環擴增始發物的形成和循環擴增伸長延伸 階段。靶序列6個特異區域和引物的結構如圖1所示，FIP引物包括： 正向內引物F2區段(與靶基因3，末端F2c互補)和F1c(與靶基因 3，末端F1c序列相同)，正向外引物F3(與靶基因3，末端F3c互補)； BIP引物包括：反向內引物B2區段(與靶基因3，末端B2c互補) 和B1c(與靶基因3，末端B1c序列相同)，反向外引物B3(與靶基 因3，末端B3c互補)。循環擴增始發物形成：DNA在60-65℃處于 動態平衡，在具鏈置換活性Bst?DNA酶的作用下，任一引物與靶基 因序列進行互補延伸時，另一條鏈就會解離。反應以正向內引物F2 為起點，與靶序列F2c配對延伸擴增模板互補鏈，與此同時，正向外 引物F3與靶序列F3c互補延伸合成模板互補DNA鏈，并置換下由 正向內引物FIP引導合成的模板鏈。被置換下的模板單鏈5，末端F1 與F1c互補，發生自我堿基配對，形成環狀結構，而反向內引物BIP 結合其另一端，引導合成互補鏈，緊接著由反向外引物B3與B3c結 合延伸，解下BIP引導合成的模板DNA單鏈。BIP引導合成的DNA 鏈兩端均有互補序列，發生自我配對，形成啞鈴狀模板DNA。循環 擴增伸長延伸階段：啞鈴狀模板DNA為循環反應的起點，為后續反 應提供原料。啞鈴結構的DNA通過自我引導延伸，生成雙鏈莖環結 構，在循環反應中，引物FIP結合到莖環DNA的環狀結構上，引導 合成新的DNA雙鏈，同時置換出與之相同序列的鏈，形成一個過渡 性莖環結構DNA，在其莖上含有一靶序列反向拷貝，而另一端通過 BIP形成一環狀結構，在隨后自我引導的鏈置換DNA合成反應中生 成一條可填補缺口，長度為靶DNA兩倍的莖環DNA。經過一系列 自我引物置換延伸合成過程，在內引物作用下進行循環反應，莖的長 度和環的個個數都逐漸增加，最后擴增產物為由DNA組成的混合物， 即含有若干倍莖環結構和類似花椰菜的結構(含有在同一鏈上由退火 形成的，在靶序列的交替反向重復序列之間的多重環狀結構)。LAMP 擴增結果判定有三種：(1)瓊脂糖電泳觀察是否產生連續的DNA擴 增條帶。(2)反應管離心肉眼觀察管底有無白色沉淀，陰性反應無此 現象，或采用濁度儀檢測管內濁度變化，可進行實時定量檢測。(3) 反應產物中加SYBR?Green?I，肉眼觀察顏色反應，呈綠色為陽性反 應，橙紅色為陰性反應。