[發(fā)明專利]肝臟前體細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910089695.4
• 申請日: 2009-07-24
• 公開（公告）號: CN101962629A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧宏魁;丁明孝;趙東昕;陳松
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué);北京華源博創(chuàng)科技有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

1.肝臟前體細(xì)胞，是由人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞分化獲得表達(dá)甲胎蛋白、角蛋白19和角蛋白7的細(xì)胞，其具有增殖能力并具有向類肝實質(zhì)細(xì)胞和類膽管細(xì)胞的雙向分化潛能。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟前體細(xì)胞，其特征在于：所述人胚胎干細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝臟前體細(xì)胞，其特征在于：所述人胚胎干細(xì)胞系為下述任一種細(xì)胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述編號為NIH的編號。

4.制備權(quán)利要求1-3中任一所述肝臟前體細(xì)胞的方法，包括如下步驟

1)將人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上培養(yǎng)；

2)步驟1)獲得的細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上培養(yǎng)；

3)步驟2)獲得的細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基III上培養(yǎng)；

4)步驟3)獲得的細(xì)胞肝臟內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞；

5)將所述肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞在STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層上用肝臟前體細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得肝臟前體細(xì)胞；

所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有質(zhì)量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V和50-200ng/ml人活化素-A的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有質(zhì)量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V，體積百分含量0.05％-0.5％的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合補(bǔ)充液和50-200ng/ml人活化素-A的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有質(zhì)量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V，體積百分含量0.5％-2％的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合補(bǔ)充液和50-200ng/ml人活化素-A的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；所述肝臟內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有20-60ng/ml人成纖維細(xì)胞生長因子-4和10-30ng/ml人骨成型蛋白-2的肝細(xì)胞培養(yǎng)基；

所述肝臟前體細(xì)胞培養(yǎng)基為含有5-25mM?HEPES，體積比分含量0.5％-2％的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合補(bǔ)充液，質(zhì)量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V，2-20mM尼克酰胺，0.2-2mM的二磷酸化抗壞血酸，0.02-0.2μM地塞米松，和5-40ng/mlEGF的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述方法還包括用流式細(xì)胞儀分選表達(dá)神經(jīng)性鈣黏附蛋白表面蛋白的細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640或Fischers。

7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)形成的多潛能干細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上培養(yǎng)24h；所述方法中，步驟1)獲得的細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上培養(yǎng)24h；所述方法中，步驟2)獲得的細(xì)胞在內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基III上培養(yǎng)24h；所述方法中，步驟3)獲得的細(xì)胞肝臟內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天。

8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，還包括肝臟前體細(xì)胞的傳代步驟；肝臟前體細(xì)胞的傳代方法為將所述肝臟前體細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，然后在STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的肝臟前體細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干細(xì)胞為可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細(xì)胞系；

所述可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細(xì)胞系優(yōu)選為下述任一種細(xì)胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述編號為NIH的編號。