[發明專利]肝臟前體細胞及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 200910089695.4
• 申請日: 2009-07-24
• 公開（公告）號: CN101962629A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 鄧宏魁;丁明孝;趙東昕;陳松
• 申請（專利權）人: 北京大學;北京華源博創科技有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及肝臟前體細胞及其制備方法與應用。

背景技術

人胚胎干細胞具有無限增殖的能力和分化的全能性，在合適的條件下可以分化為人體的各種細胞類型(Thomson?et?al.，1998)。因此，人胚胎干細胞有為各種細胞提供來源的潛力，具有巨大的應用潛能，如應用于發育過程中細胞譜系決定的機制的研究，或者是應用于各種退行性疾病進行的細胞移植。在人胚胎干細胞可分化產生的各種譜系中，肝臟細胞受到了人們格外的關注。這是因為肝臟在人體內代謝過程中起到重要的作用，具有許多重要功能，包括糖原合成，分解紅細胞，合成血漿蛋白，以及解毒等等。最近，有許多研究小組都成功的將人或者小鼠胚胎干細胞分化到肝臟譜系(Basma?et?al.，2009；Drobinskaya?et?al.，2008；Gouon-Evanset?al.，2006；Hay?et?al.，2008b；Soto-Gutierrez?et?al.，2006)。。

在早期肝臟組織生成的過程中，肝臟前體細胞是肝臟實質的主要組成部分(Zaret，2008)。通過小鼠和人的發育學研究發現，這些肝臟前體細胞是成熟肝實質細胞以及肝內膽管上皮細胞的共同前體。肝臟前體細胞向肝膽兩個譜系的分化大約是在懷孕中期才逐漸確定的(Walkup?and?Gerber，2006)。人們通過從人和小鼠胎肝中分離肝臟前體細胞并進行體外培養的方法，已經對肝臟前體細胞的特性作了初步的研究(Dan?et?al.，2006；Oertel?et?al.，2008；Schmelzer?et?al.，2007；Strick-Marchand?and?Weiss，2002；Suzuki?et?al.，2002；Tsuchiya?et?al.，2005)。在體外培養中，人肝臟前體細胞表現出強大的增殖能力，同時表現出穩定的表型(Dan?et?al.，2006)。當置于合適的條件下，肝臟前體細胞可以分化為表達ALB，儲存糖原的類肝實質細胞；以及分化為表達KRT19的膽管細胞(Schmelzer?et?al.，2007)。

盡管肝臟前體細胞的增殖能力和肝膽雙向分化潛能都已經被人們證實，但是這些肝臟前體細胞的起源和功能目前還是一個存有爭議的領域。這可能主要是因為目前人們只能從肝臟中直接分離獲得肝臟前體細胞，而早期人胚胎的缺乏極大的限制了該領域的研究。

發明內容

本發明的目的是提供一種肝臟前體細胞及其制備方法與應用。

本發明所提供的肝臟前體細胞，是由人胚胎干細胞(人ES細胞)或人誘導的多潛能干細胞(induced?pluripotent?stem?cells，人iPS細胞)分化獲得表達早期肝臟標志蛋白甲胎蛋白(AFP)和表達膽管的標志蛋白角蛋白19(KRT19)和角蛋白7(KRT7)的細胞，其具有增殖能力并具有向類肝實質細胞和類膽管細胞的雙向分化潛能。

其中，所述人胚胎干細胞來源見表1。

表1.可從商業途徑獲得的人胚胎干細胞系

本發明的另一個目的是提供一種制備肝臟前體細胞的方法。

本發明所述的制備肝臟前體細胞的方法，包括如下步驟：

1)將人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞在內胚層誘導培養基I上培養；

2)步驟1)獲得的細胞在內胚層誘導培養基II上培養；

3)步驟2)獲得的細胞在內胚層誘導培養基III上培養；

4)步驟3)獲得的細胞肝臟內胚層誘導培養基上培養，獲得肝臟內胚層細胞；

5)所述肝臟內胚層細胞在STO細胞作為飼養層上用肝臟前體細胞培養基進行培養，獲得肝臟前體細胞。

所述內胚層誘導培養基I為含有質量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V和50-200ng/ml人活化素-A的基礎細胞培養基；其中，牛血清白蛋白組分V的含量優選為0.02％-0.1％，尤其優選為0.05％；人活化素-A的含量優選為80-150ng/ml，尤其優選為100ng/ml；

所述內胚層誘導培養基II為含有質量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白組分V，體積百分含量0.05％-0.5％的胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉混合補充液和50-200ng/ml人活化素-A的基礎細胞培養基；其中，牛血清白蛋白組分V的含量優選為0.02％-0.1％，尤其優選為0.05％；人活化素-A的含量優選為80-150ng/ml，尤其優選為100ng/ml；胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉混合補充液的含量優選為0.05％-0.15％，尤其優選為0.1％；