[發(fā)明專利]酶免法測定紙片奶樣生殖激素濃度的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910089658.3
• 申請日: 2009-07-28
• 公開（公告）號: CN101598735A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發(fā)明（設計）人: 石放雄;黃攀;傅春泉;茆達干
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 錢寶英

1.酶免法測定紙片奶樣生殖激素濃度的方法，包括：

1）奶樣采集：用相同大小的濾紙片采集尾乳，紙片應飽和浸潤奶樣，紙片烘干置 于干燥器內(nèi)；

2）濾紙片奶樣制樣：將干燥后的奶樣紙片稱重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲 烷充分浸泡，震蕩30min，將抽提液轉(zhuǎn)移到玻璃器皿內(nèi)，置于干燥箱內(nèi)40℃干燥脫水， 同時收集碎紙片干燥稱重w₂，向抽提液標本中加500μl含有質(zhì)量體積比為0.1%BSA、 濃度為0.01M、pH7.0的磷酸鹽緩沖液潤洗，制成ELISA工作液；

3）包被抗體：用包被緩沖液將抗孕酮或抗雌二醇的抗體按照產(chǎn)品說明書稀釋成包 被工作液，在已編號的載體板各孔內(nèi)，第1列第A、B、C排的3孔作為對照組除外， 加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀釋液100μl，加蓋，4℃冰箱中靜置24～48小時，包被緩沖液 按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；

4）洗滌：取出反應板，甩掉包被緩沖液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干，洗滌 液按1000ml配制：500μl吐溫20、H₂O1000ml；

5）加樣：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔內(nèi)依次加稀釋后的待測樣 本100μl；B和C排重復A排加樣，G和H排重復F排加樣；D和E排按照濃度低至高 的順序依次加標準抗原，每個梯度重復3次；

6）加酶標物：加樣后，將板置于4℃冰箱中，配制酶標物，取出載體板，在各孔內(nèi) 加酶標物100μl，置37℃培養(yǎng)箱中反應2小時；

7）洗滌：取出反應板，甩掉反應板的反應液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

8）加底物液：配制底物液，在各孔內(nèi)加底物液200μl，室溫避光反應30min，此時 反應液呈藍色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、過氧化脲2ml、H₂O18ml；

9）加終止液：各孔加終止液50μl，此時反應液呈黃色，終止液按6ml配制：濃硫 酸∶水=1∶9，濃硫酸600μl、水5.4ml；

10）讀取OD值：用酶標儀在450nm波長處讀取各孔的光密度值；

11）OD值到濃度的換算：

（1）以標準孕酮或雌二醇的濃度為橫座標，結(jié)合率為縱座標，繪制標準曲線，待 測樣本的結(jié)合率在標準曲線橫座標上所對應的值乘以樣本稀釋倍數(shù)，即可求得待測樣本 的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

（2）或者將標準曲線直線化：設孕酮或雌二醇濃度為X，結(jié)合率為y，可得回歸方 程y=A+Blogx，即可求得待測樣本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

（3）或者直接使用curxpt軟件建立標準曲線，進行結(jié)合率與濃度的換算；即得待 測樣本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

12）激素濃度定量計算：

（1）pg激素/片奶樣：

（2）或者ng激素/ml奶樣：根據(jù)抽提前后紙片重量差Δw=w₁-w₂，牛奶干物 質(zhì)含量取12.5%，比重取1.02，換算得到生殖激素質(zhì)量體積濃度：