[發明專利]酶免法測定紙片奶樣生殖激素濃度的方法

無效

• 申請號: 200910089658.3
• 申請日: 2009-07-28
• 公開（公告）號: CN101598735A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發明（設計）人: 石放雄;黃攀;傅春泉;茆達干
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 錢寶英

(一)技術領域

本發明利用酶免法測定紙片奶樣生殖激素濃度的方法，屬于生物技術領域。專用 于紙片奶樣生殖激素濃度的快速準確檢測。

(二)背景技術

母畜性成熟后周期性發情的實質是卵泡期和黃體期的交替，在黃體期由于周期黃體 分泌的孕激素抑制了母畜的發情，奶牛排卵后第14d孕酮含量達到高峰。在發情周期后 期(第16d)，周期黃體被子宮內膜分泌的PG溶解，孕酮開始急劇下降，解除了對卵泡 發育的抑制作用，使這期間發育的一波卵泡得以繼續發育，最后形成第2次發情和排卵。 在卵泡發育過程中，卵泡內膜細胞分泌雌激素，使母畜產生一系列的發情表現。排卵后 又生成新黃體，奶中孕酮再次上升，這種周期變化反映了奶牛卵巢周而復始的變化。

從上述論述可知，母畜周期性發情的實質也是血液中孕激素與雌激素的周期性變化 過程，但對奶牛來說，采血比較麻煩，應激強烈，采集奶樣比較方便，奶中的孕酮和雌 二醇變化與血液中的變化高度相關。為此生產中以測定奶牛乳中孕酮和雌二醇的變化來 判定母牛的發情表現。定時排卵、輸精技術的關鍵是注射LRH后有卵泡排卵并形成黃體， 注射PG后有黃體溶解并出現發情表現，但由于生產中不同的定時排卵、輸精技術程序， 效果不一樣，這些都可通過測定乳中孕酮和雌二醇的變化來驗證。

目前國內用于激素水平測定的主要是放射免疫測定和酶聯免疫吸附測定，放射免疫 測定檢測設備要求高，檢測程序繁瑣，放射性物質對操作人員有較強的危害。酶聯免疫 吸附測定設備要求簡單，操作簡便，但傳統的酶免和放免操作中都需要定量采樣，試管 采樣不方便保存和運輸，不利于在奶牛場等生產單位推廣，所以本發明創新地采用了濾 紙片不定量(飽和浸潤)采樣，利用酶聯免疫吸附測定法定量測定奶樣中激素水平，采 樣及測定操作簡便，檢測設備要求低，有很廣闊的商業推廣前景。

(三)發明內容

技術問題

本發明的目的是解決放免測定設備要求高，有放射性物質危害，試管等定量采樣及 放免測定操作繁瑣，不利于在生產實踐中推廣的問題，提供酶免法測定紙片奶樣生殖激 素水平的的方法，對奶樣生殖激素水平快速準確測定。

技術方案

本發明利用酶免法測定紙片奶樣生殖激素濃度的方法，主要包括：

1)奶樣采集：用相同大小的濾紙片采集尾乳，紙片應飽和浸潤奶樣，紙片烘干置 于干燥器內；

2)濾紙片奶樣制樣：將干燥后的奶樣紙片稱重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲 烷充分浸泡，震蕩30min，將抽提液轉移到玻璃器皿內，置于干燥箱內40℃干燥脫水， 同時收集碎紙片干燥稱重w₂，向抽提液標本中加500μl含有質量體積比為0.1％BSA、 濃度為0.01M、pH7.0的磷酸鹽緩沖液潤洗，制成ELISA工作液；

3)包被抗體：用包被緩沖液將抗孕酮或抗雌二醇的抗體按照產品說明書稀釋成包 被工作液，在已編號的載體板各孔內，第1列第A、B、C排的3孔作為對照組除外， 加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀釋液100μl，加蓋，4℃冰箱中靜置24～48小時，包被緩沖液 按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；

4)洗滌：取出反應板，甩掉包被緩沖液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干，洗滌 液按1000ml配制：500μl吐溫20、H₂O1000ml；

5)加樣：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔內依次加稀釋后的待測樣 本100ul；B和C排重復A排加樣，G和H排重復F排加樣；D和E排按照濃度低至高 的順序依次加標準抗原，每個梯度重復3次；

6)加酶標物：加樣后，將板置于4℃冰箱中，配制酶標物，取出載體板，在各孔內 加酶標物100μl，置37℃培養箱中反應2小時；

7)洗滌：取出反應板，甩掉反應板的反應液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

8)加底物液：配制底物液，在各孔內加底物液200μl，室溫避光反應30min，此時 反應液呈藍色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、過氧化脲2ml、H₂O18ml；

9)加終止液：各孔加終止液50μl，此時反應液呈黃色，終止液按6ml配制：濃硫 酸∶水＝1∶9，濃硫酸600μl、水5.4ml；