[發明專利]合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法

無效

• 申請號: 200910087696.5
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101608173A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 張榮慶;謝莉萍;上官俊龍;李琪;劉曉軍;周玉娟
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及組織細胞培養分離技術，具體地說是從一種珍珠貝——合浦珠母貝原代培養的組織塊遷出細胞中分離單一類型細胞的技術。

背景技術

合浦珠母貝(Pinctada?fucata?Martenssi)，又稱馬氏珠母貝，屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主要分布在我國沿海，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類。近年來，由于全球氣候變化的影響，以及養殖貝類經濟目的導致珍珠貝的質量和珍珠的品質下降。進行合浦珠母貝組織細胞的培養及其分離對珍珠貝的質量和珍珠的品質有重要意義。

由于合浦珠母貝原代細胞培養過程中遷出的細胞較多，不利于細胞的分離培養和單一細胞群性質的分析。目前，對合浦珠母貝組織細胞分離純化的研究非常少，相關技術比較薄弱。

發明內容

本發明旨在提供一種從合浦珠母貝原代培養的組織塊遷出細胞中分離單一類型細胞的方法。

本發明提出的合浦珠母貝外套膜外上皮細胞的分離方法，其特征在于，所述方法含有以下步驟：

(1)配制細胞分離液梯度溶液：在離心管中，將9份細胞分離液原液與1份無鈣鎂離子的組織清洗液混合，得到100％細胞分離液溶液；將100％細胞分離液溶液與無鈣鎂離子的組織清洗液溶液以不同比例混合，制備所需的不同濃度和不同體積的細胞分離液梯度液；

(2)制備梯度層：取離心管，預先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，傾去牛血清白蛋白溶液，加入上述細胞分離液梯度液制備梯度管；將濃度漸減的細胞分離液梯度液從離心管底部輕輕地逐層鋪；

(3)加入細胞懸液：用毛細管將待分離細胞懸液鋪至梯度管中最輕地細胞分離液溶液之上；

(4)細胞分離：離心后取出離心管，將各梯度層之間界面上的細胞分部收集于離心管中，加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液，離心，棄上清，加入無鈣鎂離子的組織清洗液溶液洗滌，重新懸浮后計數細胞。

在上述的分離方法中，步驟(1)和(4)所述無鈣鎂離子的組織清洗液溶液，其配方是：NaCl?26.22g/L，KCl?1.08g/L，，NaHCO₃0.35g/L，Na₂HPO₄0.09g/L，KH₂PO₄0.06g/L，MilliQ水，調整pH為7.2-7.4，無菌過濾后使用。

在上述的分離方法中，步驟(2)所述牛血清白蛋白溶液，其配方是：將牛血清白蛋白加入到100毫升磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中，待充分溶解后使用。

本發明有如下優點：

1.本發明能從原代培養的組織塊中遷出的細胞中分離出單一類型的細胞群。在一定得梯度層內能得到單一類型細胞，可以避免細胞碎片以及較大的細胞混合團的污染。

2.對細胞損傷較小，能最大限度地保持細胞的活力，分離后的細胞還能繼續培養。分離后的細胞可以進行生理生化等后續研究。

3.易于操作。無需特殊設備，成本較低。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。

實施例：外套膜外上皮細胞細胞分離

(1)配制Percoll梯度溶液：在離心管中，將9份Percoll原液與1份D-MBSS混合，即得到100％Percoll溶液。將100％Percoll原液與D-MBSS溶液以不同比例混合，配制15％、30％、36％的Percoll梯度液。

(2)制備梯度層：取離心管，預先用1％BSA溶液浸泡管壁一段時間，傾去BSA溶液，有注射器由下至上加入上述36％、30％、15％的Percoll梯度液制備梯度管。

(3)加入細胞懸液：用毛細管將2ml待分離細胞懸液(含約5×10⁷個細胞)輕輕鋪至梯度管中15％的Percoll溶液之上，在室溫下以1000rpm/min離心5min，繼續以2000rpm/min離心15min。

(4)細胞分離：取出離心管，用毛細吸管將36％和30％界面上的細胞收集于離心管中，加入3倍體積的D-MBSS溶液，1500rpm/min離心10min，棄上清，加入D-MBSS溶液洗滌2次，重新懸浮后計數細胞。

(5)進行細胞鑒定或者其他研究。