[發明專利]一種合浦珠母貝組織培養方法

無效

• 申請號: 200910087695.0
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101591639A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 張榮慶;謝莉萍;李琪;上官俊龍;劉曉軍;周玉娟
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及組織細胞培養技術，具體地說是一種珍珠貝---合浦珠母貝的組織細胞的體外培養方法。

背景技術

合浦珠母貝(Pinctada?fucata?Martenssi)，又稱馬氏珠母貝，屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主要分布在日本和我國南海，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類，其育珠產量占世界海水珍珠產量的85％以上，也是我國主要的海水珍珠養殖貝。但是，隨著貝殼養殖歷史的延長和高密度、集約化、工廠化生產的發展，以及養殖條件環境的日益惡化，養殖病害已成為全世界，特別是我國海洋貝類生殖生產發展的重要制約因素。近年來，我國養殖的合浦珠母貝等重要經濟貝類發生大規模的爆發性死亡，造成巨大的經濟損失。研究合浦珠母貝的組織培養對于珍珠貝類的疾病控制、改進珠母貝的插核技術、提高珍珠的產量和質量有重要意義。

由于無脊椎動物培養條件與哺乳動物有較大差異，所以組織細胞培養較之哺乳動物難度大。一方面，合浦珠母貝組織表面有大量的細菌、真菌、原生動物等，組織培養過程中極易造成污染；另一方面，現有的珍珠貝組織培養技術，存在細胞貼壁效果差、生長緩慢、遷出數量較少等缺點。

發明內容

本發明旨在提供一種適合海洋珍珠貝類的合浦珠母貝組織培養的方法。

為實現上述目標，本發明采取的方案包括如下步驟：

(1)組織塊取材：取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸干，用醫用酒精擦拭貝殼表面消毒，剪去閉殼肌側的貝殼邊緣，在無菌操作臺內將閉殼肌割開，取目的組織，將取出的組織浸潤在組織平衡鹽溶液中；

(2)消毒和清洗：用紙片將組織表面的粘液沾去，將組織放入組織消毒液中浸泡，期間搖動，再將組織轉移到組織平衡鹽溶液中，換液，清洗組織表面粘液以及殘余的抗生素；

(3)組織培養：將組織塊剪成小塊，置于預先鋪有鼠尾膠原的組織培養皿中，加入培養基，培養72h后，吸棄0.5ml培養液，補加2ml新鮮的培養液，繼續培養。

在上述的培養方法，步驟(1)所述組織平衡鹽溶液，其配方是：NaCl?26.22g/L，KCl?1.08g/L，MgSO₄?2.94g/L，MgCl₂?2.0g/L，CaCl₂?0.664g/L，NaHCO₃?0.3g/L，NaII₂PO₄?0.044g/L，glucose?0.30mg/ml，MilliQ水，pH為7.2-7.4，無菌濾膜過濾后使用。

在上述的培養方法，步驟(2)所述消毒液，其配方是：青霉素100萬IU/L，鏈霉素1g/L，慶大霉素80萬IU/L，甲硝唑15mg/L，制霉菌素2mg/L溶解于組織平衡鹽溶液中，無菌濾膜過濾后。

在上述的培養方法，步驟(3)所述培養基，其配方是：：199培養基(Medium?199)和L-15培養基(Leibovitz-15medium)粉末分別溶于500ml滅過菌的MilliQ水中，室溫攪拌至完全溶解，再將兩種培養基1∶1混合，加入10.22g/L?NaCl，40μg/ml抗壞血酸維生素C，128.9μg/ml牛磺酸，10μg/ml?ATP，400μg/ml乳蛋白水解物，67mg/ml?HEPES，再加入以下抗生素：100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，50μg/ml卡那霉素和1μg/ml制霉菌素，攪拌，pH調至7.0，無菌條件下過濾，加入10％胎牛血清和10％雞胚浸液。

本發明具有如下優點：

1.適用范圍廣，易于操作：適用于合浦珠母貝的外套膜、內臟、心肌、腮等各個組織。設備要求簡單，在一般的無菌培養室內就可以完成。

2.滅菌效果較佳，能在一定限度內保護組織細胞免受損傷，又能達到比較理想的滅菌效果：由于珠母貝的組織上附生的細菌、真菌和原生動物較多。本發明的消毒液的消毒滅菌效果佳，有效降低了組織塊染菌的可能性。

3.組織塊培養過程中貼壁效果很好，細胞遷出旺盛：本方法培養8個小時后既有細胞從組織塊中遷出，培養2天后就能形成致密的單層細胞。

4.體外存活期較長：一般在不斷補充新鮮培養基的條件下，組織塊在90天后仍有細胞遷出。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。