[發(fā)明專利]一種定量檢測血液中PSA和fPSA的磁性免疫層析試紙條及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910087647.1
• 申請日: 2009-06-24
• 公開（公告）號: CN101762691A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚洪濤;應(yīng)希堂;李強(qiáng);胡國茂;鄭金來;于尚永
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科美東雅生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577;G01N33/531;G01N33/532
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，特別是涉及一種定量檢測血液中PSA和fPSA的磁性免疫層析試紙條及制備方法。

背景技術(shù)

前列腺特異性抗原(PSA)是人體前列腺上皮組織細(xì)胞分泌的絲氨酸蛋白酶，是一種分子量為30～33KDa的單鏈糖蛋白分子，編碼基因位于19q13。PSA由前列腺分泌，以低濃度釋放到健康男性的血液中，在人體中主要存在于男性前列腺組織、精液和血清中。PSA在人體中主要以游離(fPSA)和結(jié)合態(tài)(cPSA)存在，兩者總合就是總PSA。游離前列腺特異性抗原(fPSA)是指游離狀態(tài)下的PSA，它沒有與α1抗糜蛋白酶等結(jié)合。當(dāng)PSA處在“診斷灰區(qū)”(4～10ng/mL)時，fPSA的檢測就有重要意義，fPSA/總PSA的比值對診斷前列腺癌的臨床價值很大，對良性前列腺增生及前列腺癌的鑒別有顯著意義。

目前的血液中總PSA+fPSA的診斷技術(shù)主要包括：放射免疫法(RIA)，酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)、化學(xué)發(fā)光(CLIA)、時間分辨熒光、膠體金免疫層析等方法，但這些方法都有各自的特點(diǎn)及不足：放射免疫技術(shù)成熟，結(jié)果比較準(zhǔn)確，線性范圍較寬，但操作繁瑣，耗時長，且放射性標(biāo)記物會對操作者產(chǎn)生危害，并且會產(chǎn)生環(huán)境污染，目前已經(jīng)逐漸被其他方法所替代。ELISA和化學(xué)發(fā)光以及時間分辨熒光法原理類似，只在靈敏度方面有差異，目前大都已經(jīng)實現(xiàn)自動化、大批量、定量檢測，但是存在方法間結(jié)果差異大，線性范圍較窄等缺點(diǎn)，另外，自動化檢測目前由國外大廠商所壟斷，儀器設(shè)備昂貴，并且不適合單人份和較小批量檢測用，大大限制了它們在基層醫(yī)院、診所的應(yīng)用。近年來出現(xiàn)了膠體金免疫層析法來檢測總PSA，快速，便捷，單人份操作，但是缺點(diǎn)是只能實現(xiàn)半定量，只能指示一個大概范圍，無法實現(xiàn)精確定量，而且因為膠體金靈敏度的限制，無法檢測游離PSA，異常標(biāo)本需要使用其他方法復(fù)核檢測，無形中增加了被測試者的就醫(yī)成本，在市場推廣方面有較大難度，很難大面積使用。

磁性免疫層析(Mgnetic?ImmunoChromatographic?Test，MICT)是近年來出現(xiàn)的的一種新一代單人份快速定量檢測技術(shù)。是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記物(膠體金，乳膠顆粒等)來進(jìn)行免疫層析，通過檢測結(jié)合在超順磁性納米微粒上的生化物質(zhì)來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)。通過檢測測量磁場強(qiáng)度來表達(dá)標(biāo)記在樣品區(qū)域的量，采用標(biāo)記的免疫復(fù)合物-磁場強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而達(dá)到定量的目的。該技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有下述優(yōu)勢：1)分析靈敏度：比各類目測快速診斷法靈敏10-100倍；2)分析速度：可在15秒內(nèi)測量到多達(dá)6個分析位點(diǎn)的數(shù)據(jù)；3)線形范圍：在4個數(shù)量級濃度范圍內(nèi)呈線性；4)所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設(shè)計自成一體，獨(dú)立運(yùn)行，體積小，操作簡便；5)超順磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變；獨(dú)立的快速診斷色譜卡(MAR?Cassette)可直接插入MAR檢測儀，為目前許多快速臨床診斷試劑的整合提供了廣泛的開發(fā)空間；而且還避免了操作過程中人員或儀器可能發(fā)生的交叉污染，提高了分析和過程的安全性。該技術(shù)繼承了傳統(tǒng)免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優(yōu)點(diǎn)，又彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點(diǎn)，代表了當(dāng)今即時檢驗(Point?of?Care?Test，POCT)技術(shù)發(fā)展的方向和潮流，一經(jīng)問世，發(fā)展迅速，目前已經(jīng)成為替代傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)的首選。

磁性免疫層析是以磁顆粒標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)檢測標(biāo)本中的生物活性物質(zhì)，通過檢測磁性強(qiáng)度來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)，采用標(biāo)記的免疫復(fù)合物-磁場強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出待測生物樣品的量。目前常用的標(biāo)記磁顆粒為超順磁顆粒(superPMPs)，沒有外加磁場的情況下不具有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現(xiàn)出磁性，商品化超順磁顆粒都經(jīng)過表面修飾，大大方便了標(biāo)記過程，標(biāo)記簡便，重復(fù)性好。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的即是將磁性免疫層析技術(shù)應(yīng)用在總PSA+fPSA聯(lián)合定量檢測試紙條中，將總PSA抗體和兔IgG分別共價偶聯(lián)于超順磁顆粒上，二者按比例混合之后作為檢測流動相，將與之配對的總PSA和FPSA抗體以及羊抗兔IgG包被于硝酸纖維素膜上作為檢測線和質(zhì)控線，按照常規(guī)免疫層析法的原理進(jìn)行標(biāo)本的檢測，結(jié)合簡便易行的磁性檢測儀進(jìn)行檢測，在實現(xiàn)高靈敏度檢測的同時又能大大縮短檢測的窗口期，可以避免前述幾種檢測方法的種種弊端，又綜合了前述幾種方法的優(yōu)勢：可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果，測量儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。