[發明專利]一種檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒及專用引物和靶序列

有效

• 申請號: 200910087632.5
• 申請日: 2009-07-01
• 公開（公告）號: CN101591715A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 徐東剛;李伍舉;蔡欣;付文亮;曹源;鄒民吉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發明涉及一種檢測流感病毒的試劑盒，具體涉及一種檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒、專用引物和該引物所針對的靶序列。

背景技術

自2009年4月中下旬起，源自北美的甲型H1N1流感疫情開始在全球多個國家蔓延，截至北京時間六月九日十四時，世界衛生組織確認全球七十四個國家和地區共有25288例甲型H1N1流感確診病例，其中包括死亡病例139例。至此，中國內地共報告101例甲型H1N1流感確診病例。甲型H1N1流感已對人類健康產生嚴重威脅，嚴重危害了人們健康，并造成重大的經濟損失。快速、準確地進行流感病毒的檢測是防控甲型H1N1流感的關鍵，一方面為防治提供依據和爭取時間，另外可以減輕或消除社會恐慌心理。因此快速、敏感和特意的檢測試劑盒的研制具有重大應用價值和社會意義。

2000年，日本學者Notomi等發明了一種新的恒溫核酸擴增方法(Notomi?T.等，Nucleic?Acids?Res，2000，28，E63)，即環介導等溫擴增法(Loop-mediatedisothermal?amplification)，其特點是針對靶基因的多個區域設計特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件65℃下進行反應，通過引物獨特的反轉設計，對自身進行鏈置換擴增，通常60分鐘內即可完成反應。不需要模板的熱變性、退火、長時間溫度循環等過程。其擴增效率較高，可在60分鐘內將靶序列擴增10⁹～10¹⁰倍，一般能檢測到10拷貝以下的樣品。由于其引物分別針對多個不同的區域，任何一個不匹配反應就無法進行，因此出現非特異性擴增的情況極少。相關方法已用于早期SARA疾病的診斷和肺炎結核桿菌等檢測(PoonL.L.等，Clin?Chem，2004，50(6)：1050-1052；Boehme，C.C.等，Clin.Microbiol.，2007，45，1936-1940)。通過逆轉錄酶環介導等溫擴增法(reverse?transcriptionloop-mediated?isothermal?amplification)已運用于HIV-1病毒(Kelly?A.等，Journalof?Virological?Methods，2008，151，264-270)，禽流感病毒H5、H5N?1和H9等的快速診斷(Imai?M.等，Vaccine，2006，24(44-46)：6679-6682；Imai?M.等，J?VirolMethods，2007，141(2)：173-80；Chen?HT等，J?Virol?Methods，2008，151(2)：200-3)。該方法對于低濃度的病毒數量或無癥狀的病毒攜帶者的檢測比RT-PCR好，目前尚未見到利用反轉錄和等溫擴增一體化檢測甲型H1N1流感病毒核酸試劑盒的報道。

目前，檢測甲型H1N1流感病毒使用的試劑盒主要利用PCR方法和實時定量RT-PCR方法。PCR方法靈敏度和特異性均要低于環介導等溫擴增法，且操作步驟繁瑣，反應時間長；而實時定量RT-PCR方法檢測需要昂貴的實時定量PCR儀，且結果需要計算機分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測甲型H1N1流感病毒的專用引物。

本發明的目的也在于提供一種含有上述專用引物的檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒。

本發明的目的還在于提供上述專用引物的靶序列。

一種檢測甲型H1N1流感病毒的專用引物，由4條特異性引物組成，所述4條特異性引物的序列分別為：引物F1具有序列表中SEQ?ID?No.2的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ?ID?No.3的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ?IDNo.4的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ?ID?No.5的核苷酸序列。

一種檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒，包括含有上述專用引物的反應預混液。

所述反應預混液為下述成分的混合液且各成分的終濃度分別為：引物F11.76μM；引物B1?1.76μM；引物F2?0.29μM；引物B2?0.29μM；dNTP?2.05mM；1.47×Bst?DNA聚合酶緩沖液；MgSO₄?11.76mM；甜菜堿1.47M。

所述試劑盒還包括Bacillus?stearothermophilus(Bst)DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、AMV反轉錄酶和無RNA酶的ddH₂O。

所述試劑盒還包括SYBR?Green?I。

所述試劑盒還包括陽性模板和陰性模板。