[發明專利]一種脂肪酶鍵合固定相及其制備方法和用途

無效

• 申請號: 200910086839.0
• 申請日: 2009-06-08
• 公開（公告）號: CN101574646A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 周志強;呂春光;賀澤英;范鑫鑫
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01J20/29;B01J20/30
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 朱 琨

技術領域

本發明涉及一種脂肪酶鍵合固定相及其制備方法和用途，屬于色譜固定相制備領域。

背景技術

用固定化酶作為液相色譜固定相拆分對映體早有文獻報道。1988年，Wainer等人提出了用固定化糜蛋白酶作為液相色譜的固定相來拆分手性物質。拆分了很多氨基酸、氨基酸的衍生物及二肽。1989年，他們用同樣的方法合成了固定化胰蛋白酶拆分了大量O-衍生化的外消旋氨基酸。1989年，Kalbe等人固定化了糜蛋白酶和胰蛋白酶，拆分了大量芳香族和脂肪族的氨基酸酯。1992年，Marl等人合成了4種固定化糜蛋白酶，拆分了大量的對映體。2001年G.Fe′lix等人固定化了青霉素酶，他們在制得的固定相分離了大量的手性羧酸，并且該固定相作為在線反應器對某些酯也具有不對稱水解效果。到目前為止，還未有人報道將固定化脂肪酶作為液相色譜固定相用于拆分對映體。

發明內容

本發明的目的是提供一種脂肪酶鍵合固定相及其制備方法和用途，以提高酶在載體表面的鍵合量，保留酶的活性，提高柱效。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

一種脂肪酶鍵合固定相，其特征在于，該固定相由表面帶有醛基的球形硅膠填料與脂肪酶的氨基以亞胺鍵直接鍵合，而后把亞胺還原為氨基制得。

所述固定相制備方法的具體步驟為：

1)環氧基硅膠的制備：在100mL三口瓶中加入3.0g球形硅膠和50mL?10％的鹽酸溶液，加熱回流12～14h后，停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，60℃真空干燥12h，將干燥好的硅膠置于100mL三口瓶中，然后加入5～8mL?3-縮水甘油丙氧基三甲氧基硅烷和50mL無水甲苯，氮氣保護下于110℃回流攪拌反應12～14h，然后停止加熱，抽濾，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己烷洗凈，60℃真空干燥12h；

2)二醇基硅膠的制備：將上述步驟1)中制備的環氧基硅膠置于500mL三口瓶中，然后加入300mL、pH＝3～4的硫酸溶液回流攪拌反應1.5h，然后停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，室溫下真空干燥12h；

3)醛基硅膠的制備：將上述步驟2)中制備的二醇基硅膠置于100mL三口瓶中，然后加入60mL?90％的醋酸水溶液和2～3g高碘酸鈉攪拌反應2h，抽濾，用蒸餾水洗凈；

4)脂肪酶鍵合固定相的制備：稱取南極假絲酵母脂肪酶B?150～600mg，置于250mL三口瓶中，加入100mL、pH＝5～6的0.1mol/L醋酸鹽緩沖液，攪拌溶解，加入上述步驟3)中制備的醛基硅膠3g和75mg氰基硼氫化鈉，于0～4℃攪拌反應3～5天，抽濾，用pH＝8的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗凈；所得固定相在100mL?pH＝8的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中，在2～3h內分3次共加入硼氫化鈉75mg，每次25mg，以還原硅膠表面剩余的醛基，抽濾，用pH＝8的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗凈，得到所需脂肪酶鍵合固定相。

所述球形硅膠的粒徑為5～30微米，孔徑為200～4000埃。

所述球形硅膠由日本富士公司購得；所述南極假絲酵母脂肪酶B由荷蘭Chiralvision公司購得。

所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱及在線液相色譜反應器填料。

所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離手性化合物。

所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離1-萘乙醇、2-萘乙醇、1-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。

所述脂肪酶鍵合固定相用作在線液相色譜反應器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-1-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不對稱水解。

本發明的優點：

1)該脂肪酶鍵合固定相具有很高的手性識別能力，裝填有這種固定相的色譜柱，既可以用做手性色譜柱，又可以用做在線液相色譜反應器；

2)該脂肪酶鍵合固定相的化學性質相當穩定，三個月之內都可以保持相當高的活性；

3)該脂肪酶鍵合固定相的制備成本相對較低，不論是裝填分析柱還是制備柱都有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為1-萘乙醇的拆分譜圖；

圖2為2-萘乙醇的拆分譜圖；

圖3為1-萘丙醇的拆分譜圖；

圖4為2-萘丙醇的拆分譜圖；

圖5為烯唑醇的拆分譜圖；

圖6為2-萘乙醇乙酯的不對稱水解譜圖；

圖7為2-萘乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；

圖8為4-甲氧基苯乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；

圖9為4-甲基苯乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；