[發(fā)明專利]納米殼聚糖衍生物及制備方法和它的應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910086838.6
• 申請日: 2009-06-08
• 公開（公告）號: CN101575384A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發(fā)明（設計）人: 鄒霞娟;婁雅欣;鐘麗君;劉丹;楊彬;彭嘉柔
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08;C07K1/22
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學納米材料技術領域。具體而言，涉及納米殼聚糖衍生物及制備方法和利用該納米殼聚糖衍生物高選擇性和特異性富集和純化糖基化多肽/蛋白的方法。

背景技術

翻譯后蛋白質的修飾是蛋白質組學中研究的熱點課題。蛋白質的糖基化是最常見的、最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，蛋白質的糖基化幾乎調節(jié)著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發(fā)育和分化，新陳代謝，免疫應答，腫瘤發(fā)生等，一些糖基化蛋白質作為治療疾病的相關靶或生物標識物用于癌癥的早期檢測和鑒定，如癌胚抗原用于檢測直腸癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA-125用于檢測卵巣癌；專一性前列腺癌胚抗原用于檢測前列腺癌；Her2/neu用于檢測乳腺癌；等等，因此對糖基化蛋白質的分析和鑒定具有十分重要的作用。

蛋白質糖基化的一個重要特點是不均一性，即不同的糖鏈可連于同一位點以及在同一蛋白質上也可有不同的位點連接不同的糖鏈。糖基化的不均一性給糖蛋白質的分離分析帶來了很大的困難：不同糖型的同一蛋白質會在電泳上呈現(xiàn)彌散的條帶，導致信號分散，較低豐度的蛋白質得不到鑒定；造成糖蛋白質在色譜中不能良好的分離；目前，質譜技術已經發(fā)展成為鑒定糖基化蛋白的重要工具之一，質譜在鑒定糖基化蛋白時，仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，其具體體現(xiàn)是：第一，糖基化蛋白在細胞內所有蛋白中為低豐度；第二，糖基化蛋白在質譜上表現(xiàn)為一簇分辨率很差的峰，得不到準確的分子量。鑒于此，當前國際上的主要研究策略是利用現(xiàn)有技術體系，分離富集糖蛋白質/糖肽，消除糖基化的不均一性及其對質譜的影響，質量標記糖基化位點，從而揚長避短，實現(xiàn)大規(guī)模高通量糖蛋白質及糖基化位點的鑒定。目前，常用的糖蛋白質分離富集技術有：凝集素親和技術、肼化學富集法、親水相互作用色譜法等。其中凝集素親和技術對含甘露糖基和N-混多糖的糖蛋白具有較好的親和作用，但是對二觸角的N-多糖糖蛋白的親和作用較弱，對三，四觸角的N-多糖糖蛋白沒有親和作用；而肼化學富集法需一步氧化反應，從而增加了樣品制備時間和樣品的復雜性。最近開發(fā)的帶有苯硼酸的硅材料，對含有N-糖基化和O-糖基化的糖蛋白都具有較好的富集作用，適用所有的含不同結構，不同大小和親水性的糖蛋白，但是其專一性和靈敏性有待提高。

殼聚糖(Chitosan)又稱可溶性甲殼質、甲殼胺、幾丁聚糖等，化學名為2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲殼素經脫乙酰基而得到的一種天然陽離子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗腫瘤等優(yōu)異性能，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)保等行業(yè)，素有萬能多糖的美譽(R.Jayakumar?et?al.Carbohydrate?Polymers?62(2005)142-158)。甲殼素在自然界分布非常廣，是一種廉價易得的原料。未見帶有活性硼酸基官能團的殼聚糖衍生物作為固載基質來富集和純化糖基化多肽/蛋白的報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供納米殼聚糖衍生物。

本發(fā)明還提供上述納米殼聚糖衍生物的制備方法。

本發(fā)明也提供上述納米殼聚糖衍生物在富集和純化糖基化多肽/蛋白方面的應用。

納米殼聚糖衍生物，所述殼聚糖衍生物是殼聚糖與烯酸環(huán)氧丙酯發(fā)生自聚接枝反應的產物，再與氨基取代苯硼酸進行開環(huán)加成反應得到的，所述衍生物帶有活性硼酸基官能團，顆粒大小為1-300nm，優(yōu)選顆粒大小為20-100nm。

所述氨基取代苯硼酸為3-氨基苯硼酸、2-氨基苯硼酸或4-氨基苯硼酸。

所述烯酸環(huán)氧丙酯為C₃-C₈直鏈或支鏈烯酸環(huán)氧丙酯，優(yōu)選甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(GMA)或丙烯酸環(huán)氧丙酯。

所述的納米殼聚糖衍生物的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行：

(1)將殼聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再與甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯混合，加入引發(fā)劑后進行自聚接枝反應，其中，殼聚糖的含量為1.5-2.5wt％，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯的含量為2-10wt％，反應溫度為40-100℃，反應時間為0.5-4小時，得到中間體；

(2)將步驟1得到的中間體與氨基取代苯硼酸置于氯化鈉和碳酸鈉的水溶液中進行開環(huán)加成反應，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中間體的1-5倍，且占反應體系的2-10wt％，反應溫度為50-80℃，pH值為8-12，反應時間4-6小時，降至室溫后，過濾，用水洗滌至中性，得到目標產物。

所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，正丁基鋰，過硫酸鉀，硝酸鈰銨，硫代碳酸-溴酸鉀，二高碘酸銅酸鉀，過硫酸氨或硫代硫酸鈉中的一種或多種，其中，加入量為反應體系的1-5wt％。