[發明專利]一種新型肽-鏈接基-綴合物及其固相合成方法

有效

• 申請號: 200910085088.0
• 申請日: 2009-06-01
• 公開（公告）號: CN101899092A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 楊振軍;劉洋;王曉峰;張禮和
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/06;C07K1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明屬于多肽的固相合成方法及應用技術領域，具體涉及一種新型肽-鏈接基-綴合物及其固相合成方法。

背景技術

基于核酸的一些藥物如反義寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干擾RNA(siRNA)要想發展成為有用的治療藥物，提高其細胞通透性是必須解決的關鍵問題之一。很多技術已經被用來提高這類化合物的細胞內攝取，例如，高壓靜脈注射、脂質體和納米聚合物等，但是這些方法都存在不同程度的副作用而限制其發展。

細胞透膜性肽是近些年來發展起來的新興轉運載體，已經廣泛用于一些非細胞膜通透性大分子的細胞內轉運。而將其用于核酸類藥物細胞內轉運來說，主要通過將透膜性肽與寡核苷酸共價綴合實現的。用化學方法實現綴合物生成主要有三種方法：固相逐步合成法、固相片段縮合法和液相片段縮合法。在這三種方法中，固相逐步合成法具有操作簡便，底物用量少等優點。

從合成順序上可將固相逐步合成法分成兩類：1)peptide-first-oligo-next：即首先在固相上進行肽的合成，采用Boc或Fmoc策略，之后進行寡核苷酸的合成，最后進行切割及純化；2)oligo-first-peptide-next：即首先進行寡核苷酸合成，之后進行肽的合成，多采用Fmoc策略，最后進行切割及純化。

雖然全固相操作簡單，但這兩種策略都存在問題，即反應條件的兼容性問題，包括偶聯條件，脫保護的條件及切割的條件。如果首先合成肽，則肽的側鏈上的保護基必須在寡核苷酸合成的條件下穩定，即保證酸性穩定，沒有氧化性；在寡核苷酸合成之后可以脫除，即保證堿性或Pd試劑脫除。首先這樣的側鏈保護基比較少，而且會對寡核苷酸合成產生影響，例如會影響偶聯效率，常規的I₂氧化須改為tBuOOH氧化。另一方面，如果先合成寡核苷酸，問題同樣存在。寡核苷酸對酸性敏感，Boc策略不再使用，只能采用Fmoc策略，側鏈的保護基只能選取用弱酸性或催化還原的方法脫除，不僅這種保護基較少，而且如此修飾的氨基酸還需要個別制備，也阻礙了這種方法的發展。

發明內容

為了克服上述現有技術中的缺陷，本發明的目的在于提供一系列肽-鏈接基-綴合物及其固相合成方法，并且提供用于綴合肽、鏈接基和綴合物的各種連接基團。

為了達到上述目的，本發明采用如下的技術方案：

本發明提供一系列肽-鏈接基-綴合物，由每端具有連接官能團的鏈接基綴合而成，所述鏈接基在一端與肽共價綴合，在另一端與綴合物共價綴合；

其中所述鏈接基為A為取代或未取代的苯環或碳原子，n為0、1、2、3、4或5；所述綴合物為寡核苷酸。

優選的，所述肽-鏈接基-綴合物具有通式(VIII)的結構

其中X為多肽序列，A為取代或未取代的苯環或碳原子，n為0、1、2、3、4或5。

所述肽是一種由氨基酸組成的合成肽。其中肽片段包括，但不限于以下序列：SEQ?ID?NO.：1，SEQ?ID?NO.：2，SEQ?ID?NO.：3，SEQ?ID?NO.：4，SEQ?ID?NO.：5，SEQ?ID?NO.：6，SEQ?ID?NO.：7，SEQ?ID?NO.：8，SEQ?ID?NO.：9，SEQ?ID?NO.：10，SEQ?ID?NO.：11。

根據本發明，肽片段可以是肽模擬物。

在本發明的一個優選實施方案中，肽具有透膜的性質。

所述寡核苷酸包括，但不限于：反義寡核苷酸、siRNA、miRNA，PNA，酶性核酸以及其他可以與mRNA或DNA結合的寡聚核苷酸類似物，最終發揮調節基因的翻譯或轉錄作用。

所述反義寡核苷酸的靶基因包括，但不限于：腫瘤抑制基因的突變體(如p53、BRI、EIA和BRCAI)、致癌基因(如k-ras、c-myc和c-fos)、生長因子基因(如IGF?1、PDGF、酸性和堿性FGF，以及TGFβ)、編碼與多藥耐藥性相關的蛋白的基因(如MDRI)。

本發明還提供一種固相合成方法，主要包括以下步驟：

A.使用式(I)的結構與式(II)的氨化CPG樹脂合成延長鏈接臂的CPG樹脂式(III)，其中m為0、1、2、3、4或5

B.在式(III)的CPG樹脂上合成氨基酸受保護的肽基樹脂式(IV)，其中X為多肽序列

C.將式(V)綴合于肽基樹脂式(IV)，從而形成帶有肽-鏈接基的肽-鏈接基樹脂式(VI)，其中A為取代或未取代的苯環或碳原子，n為0、1、2、3、4或5