[發(fā)明專利]一步純化固定化γ-內(nèi)酰胺酶及拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910084258.3
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101544972A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭國鈞;林建東;王建軍;張星;曹燕萍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12P13/02
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 劉 萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體說是一種固定化γ-內(nèi)酰胺水解酶新技術(shù)拆分(±)2-氮雜雙環(huán)-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(γ-內(nèi)酰胺)。

背景技術(shù)

(-)γ-內(nèi)酰胺((-)2-氮雜雙環(huán)-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮)是合成許多生物活性化合物的重要中間體，可合成阿巴卡韋等抗艾滋病手性藥物。

通過手性化合物拆分來制備光學(xué)純手性化合物的方法，歸納起來：(1)根據(jù)起始原料分為外消旋體拆分法和不對稱合成法；(2)根據(jù)所用手段分為化學(xué)法和生物催化兩種類型。微生物酶法拆分技術(shù)由于具有酶促催化反應(yīng)的特點(diǎn)，而備受科研工作者的青睞。微生物酶法拆分是利用微生物細(xì)胞內(nèi)所含的酶，或用細(xì)胞中分離出的酶作為催化劑，通過化學(xué)酶催化反應(yīng)拆分外消旋體的方法。酶拆分的獨(dú)特作用是由于它們由L-氨基酸組成。其活性中心構(gòu)成了一個不對稱環(huán)境有利于識別對映體。因而酶是高度手性的催化劑，具有高度的立體選擇性。微生物種類及其體內(nèi)生物催化反應(yīng)種類繁多，因此微生物酶法拆分手性化合物的研究具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前，國內(nèi)外許多科研工作者從事利用生物轉(zhuǎn)化法拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的研究，并取得了良好的效果。Nakano?Hiroto等進(jìn)行了利用脂肪酶的立體選擇性，拆分γ-內(nèi)酰胺的外消旋體的研究；Taylor?Stephen和Talor?Steve通過完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，利用內(nèi)酰胺酶對(±)γ-內(nèi)酰胺進(jìn)行拆分，并取得良好的效果；Mahmoudian?M等提出了一種微生物酶法拆分γ-內(nèi)酰胺外消旋體化合物的方法；Toogood等克隆了嗜熱的Sulfolobus?solfataricus菌株中的γ-酰胺酶基因，分離得到γ-內(nèi)酰胺酶，該酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)，催化γ-內(nèi)酰胺水解反應(yīng)有很高的選擇性。

本發(fā)明將帶有硫磺礦硫化葉菌耐熱酰胺水解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，表達(dá)了能水解(+)γ-內(nèi)酰胺，拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的酶。游離酶的空間結(jié)構(gòu)易受各種因素：如物理因素(溫度、壓力、電磁場)、化學(xué)因素(氧化、還原、有機(jī)溶劑、金屬離子、離子強(qiáng)度、pH)和生物因素(酶修飾和酶降解)的影響，酶生物活力有可能喪失。游離酶即使在最適條件下，也會部分失活，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)速率會逐漸下降，反應(yīng)后不能回收，加大了產(chǎn)物提純難度，增加生產(chǎn)成本。所以，對于現(xiàn)代工業(yè)來說，游離酶酶并很不理想。

與游離酶相比，固定化酶具有以下的優(yōu)點(diǎn)：

(1)固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開；

(2)可以在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；

(3)提高酶的穩(wěn)定性；

(4)對酶反應(yīng)過程能夠嚴(yán)格控制；

(5)產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；

(6)酶的使用效率提高，成本降低。

固定化酶，是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用，它將游離酶的催化活動完全或基本上限制在一定空間范圍內(nèi)的過程。酶的固定化方法很多，通常按照用于結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)的類型進(jìn)行分類，分別為：吸附法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法和包埋法四大類。對于蛋白一級結(jié)構(gòu)已知的酶，結(jié)合蛋白一級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來采取相應(yīng)固定化方法。

金屬鰲合親和層析(Metal?Chelate?Affinity?Chromatography，MCAC)或固定化金屬離子親和層析(Immobilized?Metal?Affinity?Chromatography，簡稱IMAC)，是近30年發(fā)展起來的一項(xiàng)分離技術(shù)。它是利用金屬離子鰲合配體與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用的原理進(jìn)行蛋白質(zhì)分離及純化，其中以咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。由于它具有配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一。

本發(fā)明將酶一步純化固定化于金屬鰲合親和層析介質(zhì)上，與傳統(tǒng)酶固定化相比具有以下潛在的優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明一步完成酶的純化與固定化過程。傳統(tǒng)酶的純化、固定化過程，首先經(jīng)過復(fù)雜的蛋白純化過程：①硫酸銨分級沉淀法除粗蛋白，②得到的蛋白進(jìn)一步透析除鹽，③相對純一點(diǎn)的酶進(jìn)一步過DEAE-sepharose?fast?flow及強(qiáng)陽、陰離子交換柱等等柱子獲得純酶；④然后將純酶固定于載體上。