[發明專利]表達非淀粉多糖復合酶的重組巴氏畢赤酵母菌及其應用

有效

• 申請號: 200910083481.6
• 申請日: 2009-05-06
• 公開（公告）號: CN101544954A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 吳培均;李卓夫;李富偉;段文娟
• 申請（專利權）人: 北京挑戰生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/42;A23K1/165;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及一種表達非淀粉多糖復合酶的重組菌及其應用，特別涉及一種表達非淀粉多糖復合酶的重組巴氏畢赤酵母菌及其應用。

背景技術

非淀粉多糖(NSP)是植物組織中由多種單糖和糖醛酸經糖苷鍵連接而成的，大多有分支的鏈狀結構，常與無機離子和蛋白質結合在一起，是細胞壁的主要成分，一般難于被單胃動物自身分泌的消化酶所分解。

許多研究成果表明，飼料中添加NSP酶制劑，通過對飼料中抗營養因子-NSP的水解，可以降低動物胃腸道食糜黏度，消除其抗營養作用，改善飼料營養價值，提高動物生產性能。因此為了高效地、最大限度地消除日糧中NSP的抗營養作用，提高飼料消化利用率，在飼料中添加應用NSP復合酶就顯得十分重要，與此同時還可以充分發揮不同NSP酶系在底物降解上的協同效應，提高飼用酶制劑的生物學效價。

當前飼用非淀粉多糖復合酶制劑的生產方式主要有以下三種：

①完全復配法：指生產或購買各種單一酶制劑，按照酶譜配方比例進行合理配比，再加入一定的分散劑、稀釋劑并經混合而成。這是飼用復合酶早期生產普遍采用的方法。完全復配法要求各單一酶制劑的質量均可靠，同時各單酶復配時應嚴格按照酶譜配方來執行。該方法缺點較多，如基礎數據的缺乏使得飼用復合酶酶譜配方的合理設計較為困難，各種商品純酶制劑的高成本使得復配后飼用復合酶的成本較高；此外，完全復配法所生產的飼用復合酶很難獲得除酶功能以外的可促進動物生長的一些未知生長因子等。

②單菌株發酵法：在自然界中篩選能夠同時分泌表達多種非淀粉多糖酶的菌株，并利用各種誘變的方法獲得符合配方要求的優良高產菌株，經發酵制取所得的粗酶即為復合酶制劑。然而大多數菌株在分泌酶時會根據培養基中底物的組成而進行有選擇性的分泌酶，故利用該法獲得的復合酶制劑實質上僅以一種或兩種酶制劑為主，而其它相應酶制劑的分泌量較少且活性很低。目前工業用復合酶的來源主要是好氧絲狀真菌木霉屬和曲霉屬，木霉菌發酵產物中存在多種真菌毒素，有毒性嫌疑，且絲狀真菌發酵較難控制，菌種易退化。

③多菌株混合發酵：將各個菌株混合接種，一次發酵形成符合配方要求的復合酶制劑產品。該法理論上可行，但實際生產操作過程中因不同菌種發酵產酶的條件及需求各異，彼此間相互拮抗，故該技術應用難度很大。

發明內容

本發明的目的在于提供表達非淀粉多糖復合酶的重組巴氏畢赤酵母菌及其應用。

本發明的重組菌，是含有木聚糖酶基因、纖維素酶基因和β-甘露聚糖酶基因的重組巴氏畢赤酵母菌。

上述木聚糖酶基因的編碼序列是自Genbank號為AJ292317的5′端第1-576位的核苷酸序列；上述纖維素酶基因的核苷酸序列是自Genbank號為EU022559的5′端第88-1500位的核苷酸序列；上述β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列是自Genbank號為AY623903的5′端第122-1051位的核苷酸序列。

其中，所述木聚糖酶基因通過重組表達載體a導入所述巴氏畢赤酵母菌中，構成重組巴氏畢赤酵母菌A，該重組表達載體a是將所述木聚糖酶基因插入到表達載體pPIC9中得到的表達木聚糖酶的重組表達載體。

所述纖維素酶基因通過重組表達載體b導入所述重組巴氏畢赤酵母菌中A，構成重組巴氏畢赤酵母菌B，該重組表達載體b是將所述纖維素酶基因插入到表達載體pPIC9K中得到的表達纖維素酶的重組表達載體。

所述β-甘露聚糖酶基因通過重組表達載體c導入所述重組巴氏畢赤酵母菌B中得到本發明的重組菌；所述重組表達載體c是將所述β-甘露聚糖酶基因連接到表達載體pPICZαA上得到的表達β-甘露聚糖酶的重組表達載體。

所述巴氏畢赤酵母菌為巴氏畢赤酵母菌(Pichia?pastoris)GS115。

上述重組菌為巴氏畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115-NSP，已于2009年04月16日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區大屯路)，保藏號為CGMCC?№.3025。

本發明的另一目的在于提供所述的重組菌在生產非淀粉多糖復合酶中的應用。

所述應用是將本發明的重組菌，在溫度28-30℃，pH5.0-6.0，溶氧為30％-60％，進行誘導發酵，表達出非淀粉多糖復合酶。