[發(fā)明專利]一種篩選疾病標(biāo)志物的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910083074.5
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101538614A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚蔚泓;上官棣華;方曉紅;王柯敏;楊朝勇
• 申請（專利權(quán)）人: 譚蔚泓
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C40B30/04;C12P19/34;C12Q1/48
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種篩選疾病標(biāo)志物的方法。

背景技術(shù)

疾病的發(fā)生、發(fā)展均導(dǎo)致細(xì)胞中相關(guān)分子的種類和數(shù)量發(fā)生變化，這些與特定疾病密切相關(guān)的分子就是疾病標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)和尋找疾病標(biāo)志物，并從分子水平檢測和跟蹤這些變化是理解疾病發(fā)生機(jī)理、提高診斷準(zhǔn)確性、提早診斷窗口期、制定合理治療方案以及監(jiān)測治療效果的一個(gè)非常有效途徑。目前用于尋找疾病標(biāo)志物的方法一般是質(zhì)譜與二維電泳聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。但是該方法在膜蛋白的鑒別方面有很大的局限性，主要因?yàn)槟さ鞍椎娜芙庑圆睢Ｋ械牡鞍字写蠹s有30％是膜蛋白，目前只有不到5％膜蛋白可通過二維電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別出來(Wu，C.C.；Yates，J.R.III.The?application?of?mass?spectrometry?to?membrane?proteomics.Nat.Biotechnol.2003，21，(3)，262-7)。膜蛋白是在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和與外界物質(zhì)交換中起關(guān)鍵性作用的分子，很多疾病的發(fā)生、發(fā)展都會引起膜蛋白的變異，導(dǎo)致膜蛋白的種類和數(shù)量發(fā)生變化，而這些變化的膜蛋白就是潛在的疾病標(biāo)志物分子。另外對于非蛋白類細(xì)胞膜表面的疾病標(biāo)志物分子，上述的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法也是無能為力的。如何有效的發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物分子依然是目前分子細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種篩選疾病標(biāo)志物的方法。

本發(fā)明所提供的篩選疾病標(biāo)志物的方法，包括如下步驟：

(a)用離體的靶疾病細(xì)胞對核酸文庫進(jìn)行篩選，得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體；所述核酸文庫為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫；

(b)將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合，得到所述核酸適體和所述靶分子的復(fù)合物，再分離所述復(fù)合物，得到所述靶疾病細(xì)胞上的靶分子，即為靶疾病標(biāo)志物。

其中，在所述步驟(a)后、步驟(b)前，還可包括將所述核酸適體標(biāo)記的步驟。這樣得到標(biāo)記的與靶疾病相關(guān)的核酸適體，在步驟(b)中用標(biāo)記的與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合；標(biāo)記利于后續(xù)靶分子的分離與檢測。

所述將核酸適體標(biāo)記具體可以將核酸適體標(biāo)記上信號分子(如羅丹明B、熒光素)、活性分子(如生物素、氨基、羧基)。

所述核酸文庫具體可為單鏈DNA文庫、單鏈RNA文庫、或修飾的單鏈核酸文庫。所述隨機(jī)核苷酸序列的長度可為25-60個(gè)堿基，優(yōu)選為52個(gè)堿基。

所述核酸文庫具體可以為如下的文庫：兩端為15-25個(gè)堿基的固定核苷酸序列，中間為25-60個(gè)堿基的隨機(jī)核苷酸序列，如5’-ATA?CCA?GCT?TAT?TCA?ATT-52-nt-AGA?TAG?TAA?GTG?CAA?TCT-3’。其中，兩端固定序列可以用于設(shè)計(jì)引物，以便于擴(kuò)增篩選出的文庫。

所述步驟(a)中篩選的方法包括如下步驟：

(1)以所述核酸文庫為起始核酸文庫；

(2)將所述起始核酸文庫的溶液與所述離體的靶疾病細(xì)胞孵育，得到所述靶疾病細(xì)胞與起始核酸文庫中部分核酸分子的復(fù)合體，分離復(fù)合體，得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫；

(3)將所述與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫的溶液與離體的非靶疾病細(xì)胞孵育，分離去除與所述離體的非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，剩余沒有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子；

(4)得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體。

其中，所述步驟(2)中，在所述得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫后，還可包括如下步驟：PCR擴(kuò)增所述與離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫，并制備成單鏈。

所述步驟(3)中，在所述剩余沒有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子后，還可包括如下步驟：PCR擴(kuò)增所述沒有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，并制備成單鏈。

所述步驟(a)中篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟(4)之前，還可包括至少1次以下操作：以所述沒有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的沒有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫。

所述步驟(a)中，在所述得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體后、所述將所述核酸適體標(biāo)記前，還可包括對所述核酸適體進(jìn)行修飾的步驟；所述修飾的方法為對所述核酸適體進(jìn)行剪切、對所述核酸適體中的核苷酸單元進(jìn)行替換、對所述核酸適體中的堿基、核糖或磷酸骨架進(jìn)行修飾。