[發明專利]一種生產α干擾素的方法及其專用菌

有效

• 申請號: 200910081495.4
• 申請日: 2009-04-09
• 公開（公告）號: CN101531967A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 畢清貴;畢清華
• 申請（專利權）人: 北京中科拜克生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及一種生產α干擾素的方法及其專用菌。

背景技術

養豬業是我國農村除種植外的第一大產業，其收入占農民年總收入的三分之一，是農民現金收入的主要來源。在養豬業中，藍耳病、豬“高熱病”、仔豬病毒性腹瀉和豬傳染性胸膜炎死亡率較高，對養豬業威脅最大，是獸醫界難以解決的難題。特別是2006年夏秋之際，我國部分地區發生豬“高熱病”疫情，對養豬業造成很大損失。2007年3月，農業部將高致病性豬藍耳病作為豬病防控重點，防止疫情在豬病高發季節擴散蔓延。然而目前尚未出現有效的免疫治療試劑。傳統療法是注射“病毒靈”或“病毒唑”，此類化學藥物不僅療效差且易導致畜類食品藥殘超標。

干擾素是由脊椎動物細胞產生的一類分泌型糖蛋白，具有廣譜抗病毒和增強免疫應答的作用，在免疫應答調控中處于中心地位。在醫學臨床方面，IFN常用于病毒性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的治療，并且是惟一個被FDA批準治療慢性丙型肝炎的藥品；在獸醫臨床應用方面，主要是使用IFN進行預防和治療病毒和細菌的感染。干擾素在生物體中普遍存在，現已經證明在人及小鼠、羊、兔、犬、鼬等哺乳動物，以及大量野生動物、魚類、龜類和昆蟲等都有干擾素類似物質存在。干擾素是一個大的基因家族，可分為3型，主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ等。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于制備α干擾素的重組菌。

本發明所提供的重組菌，是向宿主菌中導入如下基因得到的：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；

3)與1)限定的DNA序列有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子。

所述基因可以是通過重組載體導入所述宿主菌中的；所述重組載體具體可以是通過向出發載體pBV220的多克隆位點插入所述基因得到的。

所述宿主菌可為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌或酵母菌。

所述重組菌具體可為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)DH5α/pBV220/Sw?IFN-αCGMCC?NO.2845。該菌株已于2009年1月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC?No.2845。保藏期限為30年，分類命名為：大腸埃希氏菌Escherichia?coli。

本發明的另一個目的是提供一種制備α干擾素的方法。

本發明所提供的制備α干擾素的方法，包括如下步驟：發酵上述任一所述重組菌，得到α干擾素。

其中，所述發酵的條件可包括：溫度為25-35℃，溶氧為20-40％(體積百分含量)，以100-300r/min的速度振蕩，旋轉半徑為13mm，pH值為6.5-7.5。

所述溫度優選為30℃，所述溶氧優選為30％，所述pH值優選為7.0，所述振蕩的速度優選為200r/min。

所述發酵中所用的培養基的組成可為：每升培養基中含有胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl?10g/L，甘油30g/L，pH7.2，氨芐青霉素100mg/L，溶劑為水。

所述方法中還可包括在所述發酵后進行純化的步驟；所述純化的方法為依次進行強陰離子交換層析和陽離子交換層析。

所述方法中，在所述發酵后和所述純化前，還可包括如下分離的步驟：

1)在所述發酵后，將所述菌破碎，用變性液溶解，得到溶解液；

2)將所述溶解液與0-4℃復性緩沖液混勻，過夜；

所述變性液為含有5-7mol/L鹽酸胍、1.5-2.5mmol/L?EDTA、40-60mmol/LTris·Cl、9-11mmol/L?DTT、pH值為8-9的溶液；

所述復性緩沖液為含有0.4-0.6mol/L?L-Arg、1-3mmol/L?EDTA、10-30％(體積百分含量)甘油、0.8-1.0mmol/L?GSSG，0.05-1.15mol/L?Tris·Cl、pH?7-9的溶液。