[發明專利]一種懸浮培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法

有效

• 申請號: 200910081044.0
• 申請日: 2009-03-31
• 公開（公告）號: CN101851608A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 陳文慶;王建超;劉俊生
• 申請（專利權）人: 北京清大天一科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

技術領域

本發明涉及培養細胞生產病毒的方法，特別是涉及一種懸浮培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法。

背景技術

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies?Virus)引起的人畜共患的傳染病，是世界上病死率最高(幾乎達100％)的疾病。哺乳動物尤其是狗和貓均易感染。并且作為狂犬病病毒的寄主的貓和狗還可以將狂犬病病毒傳播給人。因此對狂犬病的流行病學控制，主要依靠擴大動物疫苗接種免疫覆蓋范圍；尤其隨著近年來家養寵物數量的增多，更需要增強對犬和貓等寵物免疫接種進行嚴格管理。高質量的獸用狂犬疫苗是保障免疫成功的基礎；而要制備狂犬疫苗，尤其是獸用狂犬疫苗首先需要大規模生產狂犬病病毒毒種。

目前，狂犬疫苗(比如獸用狂犬病疫苗)所必需的狂犬病病毒的生產主要是通過培養BHK21細胞，并在BHK21細胞上增殖狂犬病病毒的工藝來進行。由于BHK21細胞貼壁依賴的特性，現有技術認為，培養BHK21細胞的方法必須為BHK21細胞提供附著的表面。通常認為單純懸浮培養貼壁依賴的BHK21細胞，在用于生產狂犬病病毒時，很難保證使狂犬病病毒(即狂犬病疫苗的毒種)對之產生足夠的敏感性。

現有有效的培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法主要是轉瓶培養。即用BHK21細胞培養基在多個轉瓶中培養BHK21細胞，待BHK21細胞形成貼壁單層后，棄去BHK21細胞培養基，按轉瓶培養體積的1％-10％的量接種狂犬病病毒種子液，使病毒感染復數MOI達到0.01-0.5，隨即加入病毒維持液，然后再一次性加入無菌的7.5％的NaHCO₃溶液控制pH值，置于34～36℃下，培養4～5日，收獲病毒液。將收獲的病毒液在-15℃以下凍融1次，然后定量分裝，置-20℃保存。

轉瓶培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法的缺點：

1、大規模轉瓶培養BHK21細胞時，會使用成百上千個轉瓶，但每個轉瓶是一個獨立的培養單位，每個轉瓶中所培養的細胞狀態以及病毒產量都不相同，因此無法有效的控制所產生狂犬病病毒的數量和質量，更無法有效控制由狂犬病病毒所生產的疫苗質量。

2、采用轉瓶培養BHK21細胞，由于BHK21細胞貼壁生長的特性，需要對BHK21細胞進行消化操作以傳代；此外，在接種病毒、添加及更換病毒維持液、添加NaHCO₃調節pH值以及最終收獲培養物，需要多次打開轉瓶操作，受污染的風險大。

3、轉瓶培養BHK21細胞，培養能夠達到的細胞密度低，一般約為1×10⁶細胞/ml。并且每個轉瓶都需要人工無菌操作，工作勞動強度大，人為誤差大，無法實現自動化。

4、轉瓶培養的BHK21細胞，沒法隨時取樣計數細胞，接種狂犬病毒時很難準確的確定接種的病毒量。因為現有技術采用估計的辦法，即采用轉瓶培養體積的1-10％的量來接種狂犬病毒種子液。

綜上，現有轉瓶培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法自動化程度低，勞動強度大，每個轉瓶內的細胞培養環境的不可控，因而導致BHK21細胞，在BHK21細胞中生長的狂犬病病毒，以及最終的狂犬疫苗質量不穩定，產品批次差異大。

發明內容

為了克服現有轉瓶培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法所存在的上述缺陷，發明人經過研究，提供了一種懸浮培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法，該方法可以實現懸浮培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的自動化，因而簡單、高效，并且污染幾率小、用該方法得到的狂犬病病毒批次差異小，最終疫苗產品質量穩定。

現有技術一般認為單純懸浮培養貼壁依賴的BHK21細胞，在用于生產狂犬病病毒時，很難保證使狂犬病病毒(即狂犬病疫苗的毒種)對之產生足夠的敏感性。本發明的發明人克服了現有技術的偏見，大膽采用懸浮培養的方法培養貼壁依賴的BHK21細胞生產獸用狂犬疫苗，使用本發明的方法不但能夠懸浮培養貼壁依賴的BHK21細胞，而且懸浮培養所得貼壁依賴的BHK21細胞生產狂犬病病毒時，能夠保證狂犬病病毒對BHK21細胞的敏感性。

本發明提供的懸浮培養BHK21細胞生產狂犬病病毒的方法包括以下步驟：

1)在裝有BHK21細胞培養基的生物反應器中懸浮培養BHK21細胞；

其中，所述步驟1)懸浮培養的條件包括：32-36℃的溫度、7.0-7.8的pH值和30-50％的溶氧濃度；所述BHK21細胞培養基包括分散劑和下表1所示的組分。

表1