[發(fā)明專利]磷酸化和/或糖基化蛋白質(zhì)或多肽的一步富集修飾測(cè)定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910080874.1
• 申請(qǐng)日: 2009-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN101846649A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷梅;魏瑋;程智慧;盧小利;馮玉萍;黃智華;胡笳;蔡輝;趙鐳;劉沖;張凌鋒;王芹珠;林天舒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/62
• 分類號(hào): G01N27/62;C07K1/13;C07K1/107
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及磷酸化和/或糖基化蛋白質(zhì)及多肽的分離富集方法和位點(diǎn)測(cè)定。

背景技術(shù)

磷酸化是最常見的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾，在三分之一的真核基因表達(dá)產(chǎn)物中都存在這種修飾。它調(diào)節(jié)著基本的細(xì)胞行為：細(xì)胞分裂，生長(zhǎng)，分化。由于用基因序列無法預(yù)知磷酸化和其他翻譯后修飾，研究者們就發(fā)展了一些其他的方法。

傳統(tǒng)的測(cè)定磷酸化位點(diǎn)的方法一般包括：在菌種培養(yǎng)生長(zhǎng)基中對(duì)磷酸化位點(diǎn)的放射性標(biāo)記術(shù)，然后用免疫沉淀法或者SDS-PAGE法，經(jīng)酶消化，進(jìn)行Edman降解分離含有32P同位素標(biāo)記的蛋白。這種方法，除了對(duì)操作員健康的潛在危害以外，磷肽低豐度也降低了敏感性，和放射性標(biāo)簽的無效結(jié)合，自動(dòng)edman測(cè)序的低靈敏度限制了大量生物樣品的應(yīng)用。

質(zhì)譜，一直被用來鑒定蛋白質(zhì)，現(xiàn)在被認(rèn)為是表征翻譯后修飾蛋白質(zhì)的最好技術(shù)。這種方法快速、靈敏而且不需要放射性標(biāo)簽。兩種軟電離技術(shù)——機(jī)制輔助激光解析電離質(zhì)譜和電噴霧質(zhì)譜，已經(jīng)被成功的應(yīng)用于蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的檢測(cè)。但是，由于以下原因，用質(zhì)譜進(jìn)行常規(guī)的磷酸化蛋白質(zhì)表征的廣泛應(yīng)用仍然存在制約。

第一、由于磷酸基團(tuán)自身帶有負(fù)電荷抑制了離子化效率，在質(zhì)譜的正離子模式下，特征峰的強(qiáng)度很低，難以被檢測(cè)到。

第二、蛋白質(zhì)混合中，相對(duì)于非磷酸化多肽，磷酸化多肽化學(xué)含量非常低，使得混合物中磷酸化多肽全部表征變得困難。

第三、磷酸肽的親水特性也許會(huì)導(dǎo)致在RP-HPLC中被洗掉。

第四、難以對(duì)特異的大的磷酸化蛋白水解片段進(jìn)行全面的測(cè)序。

因此，設(shè)計(jì)一種方法，通過在蛋白質(zhì)或多肽的翻譯后修飾位點(diǎn)上添加捕獲標(biāo)簽，并通過高效化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行富集，并在專一的切割過程中產(chǎn)生質(zhì)譜質(zhì)量標(biāo)簽以及質(zhì)譜信號(hào)增益標(biāo)簽的話，即能達(dá)到快速高效富集修飾蛋白質(zhì)或多肽以提高翻譯后修飾位點(diǎn)測(cè)定效率的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種磷酸化和/或糖基化蛋白質(zhì)或多肽的一步富集修飾測(cè)定方法。

本發(fā)明提供的磷酸化和/或糖基化蛋白質(zhì)或多肽的富集修飾測(cè)定方法，包括如下步驟：

1)蛋白質(zhì)或多肽的端炔基或疊氮基修飾：

將目標(biāo)底物與飽和氫氧化鋇水溶液、端炔基標(biāo)簽化合物的乙醇溶液混合，溫育后得到端炔基修飾的目標(biāo)底物；

其中，目標(biāo)底物為磷酸化及糖基化蛋白質(zhì)或多肽，具體可為磷酸化絲氨酸、氧連接糖基化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸或氧連接糖基化蘇氨酸殘基；

2)端炔基修飾的蛋白質(zhì)或多肽的樹脂捕獲：

在上述端炔基修飾的目標(biāo)底物中加入疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂，并加入抗壞血酸和硫酸銅的混合物或碘化亞銅，以點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將端炔基修飾的目標(biāo)底物捕獲到該疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂上；

3)樹脂上端炔修飾多肽/蛋白的切割：

將疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂上連接的端炔基修飾的目標(biāo)底物分子切割下來，同時(shí)在端炔基修飾的目標(biāo)底物分子末端自動(dòng)形成一個(gè)質(zhì)譜信號(hào)增益標(biāo)簽，之后利用質(zhì)譜完成磷酸化和/或糖基化蛋白質(zhì)或多肽的測(cè)定。

該方法的步驟1)中，端炔基標(biāo)簽化合物的結(jié)構(gòu)通式如式I所示，

式I結(jié)構(gòu)通式中，R₀為R-X-、笏基保護(hù)氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護(hù)氨基端賴氨酸酯基；

其中，R-X-中，R為SH-或-NH₂，X為主鏈碳原子個(gè)數(shù)為1～6、總碳原子個(gè)數(shù)為1～10的烷基鏈或含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個(gè)數(shù)為2～8、總碳原子個(gè)數(shù)為2～12的烷基鏈。

當(dāng)X為含酯基或酰胺基的烷基鏈的標(biāo)簽化合物時(shí)，制備上述端炔基標(biāo)簽化合物的方法，包括如下步驟：

1)將巰基羧酸或半胱氨酸進(jìn)行巰基保護(hù)反應(yīng)；

2)將所述步驟1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行酯化或酰胺化反應(yīng)；

3)將所述步驟2)得到的產(chǎn)物進(jìn)行巰基的脫保護(hù)反應(yīng)，得到所述端炔基標(biāo)簽化合物。

該方法中，所述步驟1)中，巰基保護(hù)反應(yīng)是按照下述a-d中的任意一種方法進(jìn)行的：

a、將巰基羧酸或半胱氨酸與S，S-二苯基-S-甲氧基硫腈于有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)；

所述巰基羧酸或半胱氨酸與對(duì)甲基苯磺酰氯的摩爾比為1∶2；反應(yīng)時(shí)間為30℃，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)；

b、將巰基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中，加入芐氯進(jìn)行反應(yīng)；

所述巰基羧酸或半胱氨酸與芐氯的摩爾比為1∶1-2，優(yōu)選1∶1.2；反應(yīng)時(shí)間為30分鐘，反應(yīng)溫度為25℃；所述乙醇和氨水的混合液中，乙醇和氨水的體積比為3∶1-3；