[發明專利]磷酸化和/或糖基化蛋白質或多肽的一步富集修飾測定方法

無效

• 申請號: 200910080874.1
• 申請日: 2009-03-26
• 公開（公告）號: CN101846649A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 李艷梅;魏瑋;程智慧;盧小利;馮玉萍;黃智華;胡笳;蔡輝;趙鐳;劉沖;張凌鋒;王芹珠;林天舒
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;C07K1/13;C07K1/107
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.磷酸化和/或糖基化蛋白質或多肽的富集修飾測定方法，包括如下步驟：

1)將目標底物與飽和氫氧化鋇水溶液、端炔基標簽化合物的乙醇溶液混合，溫育后得到端炔基修飾的目標底物；

其中，所述目標底物為磷酸化蛋白質或多肽，或糖基化蛋白質或多肽；

2)在所述端炔基修飾的目標底物中加入疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂，并加入碘化亞銅、抗壞血酸或硫酸銅中的任意一種，以點擊化學反應將所述端炔基修飾的目標底物捕獲到所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂上；

3)將所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂上連接的所述端炔基修飾的目標底物分子切割下來，同時在所述端炔基修飾的目標底物分子末端自動形成一個質譜信號增益標簽，之后利用質譜完成所述磷酸化和/或糖基化蛋白質或多肽的測定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中，目標底物為磷酸化絲氨酸、氧連接糖基化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸或氧連接糖基化蘇氨酸殘基；溫育溫度為25-50℃，優選45℃；溫育時間為2-24小時，優選4小時；

所述步驟2)中，所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式VIII或式IX所示；

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂是按照如下方法進行制備的：

在1-羥基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽和4-二甲氨基吡啶存在的條件下，將端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應，得到所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述端羥基樹脂為林克-酸樹脂或4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂；

所述端氨基感光樹脂為α-甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂或α-甲基-6-硝基-藜蘆基醇聚苯乙烯樹脂；

所述疊氮基修飾的羧酸為疊氮丙酸或疊氮丁酸；

所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂的粒徑為50-100目；

所述端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸的摩爾比為1∶2-1∶6；

所述反應溫度為20-60℃，反應時間為0.5-8小時；所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂均是用二氯乙烷溶脹的；

所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應的介質為N，N-二甲基甲酰胺。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中，切割步驟包括如下具體步驟：

1)在6-氟異丙醇中溫育15分鐘-4小時，優選30分鐘；溫度為20～60℃，優選30℃；

2)在乙腈與乙酸的體積比為1∶0.05-0.3的混合液中溫育15分鐘-4小時，優選30分鐘；溫度為20～60℃，優選30℃；乙腈與乙酸的體積比優選1∶0.1。

6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中，端炔基標簽化合物的結構通式如式I所示，

所述式I結構通式中，R₀為R-X-或笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基；

其中，所述R-X-中，R為SH-或-NH₂，X為主鏈碳原子個數為1～6、總碳原子個數為1～10的烷基鏈、含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2～8、總碳原子個數為2～12的烷基鏈。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述式I結構通式中，R₀為R-X-；所述R-X-中，R為SH-或-NH₂，X為含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2～8、總碳原子個數為2～12的烷基鏈。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述式I結構通式中，R₀為R-X-；所述R-X-中，R為SH-或-NH₂，X為主鏈碳原子個數為1～6、總碳原子個數為1～10的烷基鏈。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述式I結構通式中，R₀為笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基。