[發明專利]一種檢測鼠疫菌的基因液相芯片及其檢測方法

有效

• 申請號: 200910080260.3
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101560560A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 王靜;文海燕;楊宇;孫肖紅;胡孔新;劉衡川
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種檢測鼠疫菌(Yersinia?pestis，Y.p)的基因液相芯片及其 制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。

背景技術

液相芯片檢測是近幾年發展起來的新興技術，具有快速、特異、敏 感的特點。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏 色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5μm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據 不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。

鼠疫耶爾森菌為烈性傳染病鼠疫的病原體，屬腸桿菌科耶爾森菌屬。 鼠疫病死率高，傳播快，是經典的標準生物戰劑，曾給人類帶來過巨大 的災難。回顧歷史上作為生物戰劑使用過的致病因子，鼠疫是僅次于天 花的對人類最具破壞力的疫病之一。

實驗室診斷是確診鼠疫最重要的依據，目前鼠疫的檢測主要還有常 規方法細菌學檢測、免疫學方法以及分子生物學方法等。細菌學檢測包 括菌體形態檢查、分離培養、鼠疫噬菌體裂解實驗和動物實驗。免疫學 方法如間接紅細胞凝集試驗(IHA)、反向間接紅細胞凝集試驗(RIHA)、酶 聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析法等，多以特異性莢膜抗原- F1抗原為基礎。近年來，分子生物學方法在鼠疫菌的檢測中得到廣泛應 用，PCR、套式PCR、多重PCR以及熒光定量PCR等用于鼠疫菌的檢測 均見報道。

發明內容

本發明涉及一種改進的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯 片可以用于病原體鼠疫菌的檢測。本發明還涉及利用所述的基因液相芯 片進行檢測的方法。

經過深入和大量的研究和實驗，本發明以鼠疫菌染色體標識序列為 靶序列，建立了鼠疫菌的基因液相芯片和檢測方法，為該菌的檢測提供 一條可行的途徑。

本發明所述的基因液相芯片包括：微球、捕獲探針、引物、PCR反 應體系、鏈親和素-藻紅蛋白，該基因液相芯片可檢測鼠疫菌。

本發明還涉及上述可檢測鼠疫菌的基因液相芯片，該芯片包括：熒 光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應體系、鏈親和素-藻紅蛋白。

本發明的PCR反應體系包括：10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq?DNA聚 合酶。

本發明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素標記的Yp-R。

具體例如是Yp-R：5’-生物素-TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC。

本發明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性：

??探 ??針 ??名 ??稱 ??探針靶位 ??探針序列(5’-3’) ??Yp ??鼠疫菌染色體標識序列 ??181-205bp ??AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA

本發明中，上面所述捕獲探針在合成時在5’端進行氨基修飾，并且 連接15-20個T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球 進行偶聯。

本發明的微球，一般選擇熒光編碼的微球，例如來源于Luminex或 其他代理公司的任何編號的微球，特異性探針與熒光編碼微球偶聯形成 檢測微球，由此構成檢測芯片。