[發(fā)明專利]一種檢測鼠疫菌的基因液相芯片及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910080260.3
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101560560A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王靜;文海燕;楊宇;孫肖紅;胡孔新;劉衡川
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 尹振啟

1.一種檢測鼠疫菌(Yersinia?pestis)的基因液相芯片，該芯片包括：熒光 編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白； 其中所述引物包括：

??Yp-F ??ACTCAATGTTGTGACGAGGATG ??Yp-R ??TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC

下游引物5’端經(jīng)生物素標(biāo)記：

Yp-R：5’-生物素-TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC

其中所述捕獲探針選自：

上面所述探針在合成時在5’端進行氨基修飾，并且連接15-20個T 或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進行偶聯(lián)。

2.權(quán)利要求1所述的基因液相芯片檢測鼠疫菌的非診斷性檢測方法，該 方法包括：提取鼠疫菌的基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀測定其濃度， 進行系列稀釋，PCR擴增后，按檢測步驟進行檢測，Bio-Plex?Version?4.0 分析，擬合出劑量-反應(yīng)曲線和曲線方程，樣本檢測值代入方程實現(xiàn)定量 檢測；

其中所述檢測步驟包括：

1)取偶聯(lián)微球，裝于PCR管中，根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應(yīng)加入量；

2)向各管中加5～17μl?PCR擴增得到的產(chǎn)物，混勻；

3)95℃變性10分鐘；隨后45～60℃反應(yīng)10～30分鐘；

4)離心或抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物；

5)再向各孔加鏈親和素-藻紅蛋白，室溫避光孵育，抽濾去掉未結(jié)合的 鏈親和素-藻紅蛋白；

6)再向各孔加入75μlTE懸浮液，振蕩使微球重懸；上檢測儀器進行檢 測。

3.權(quán)利要求2所述的非診斷性檢測方法，其中所述提取鼠疫菌的基因組 DNA包括以下步驟：

1)向每管樣本中加入6mol/L?NaI，振蕩混勻，煮沸；

2)離心，轉(zhuǎn)上清液至另一含20％玻璃粉液的離心管中；

3)充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/ 分鐘離心，小心傾去上清液；

4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75％乙醇1ml，充分混勻，離心，小心傾 去上清液；

5)重復(fù)步驟4)，然后置于37℃恒溫箱內(nèi)干燥；

6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20μl?TE，充分混勻，65℃加熱， 離心，回收上清液備用。