[發明專利]一種炭疽芽孢桿菌芽孢的蛋白質懸浮芯片制備及定量檢測方法

無效

• 申請號: 200910080259.0
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101504415A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 王靜;周蕾;孫肖紅;楊宇;胡孔新;楊瑞馥
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/546
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種炭疽芽孢桿菌(Bacillus?anthracis)芽孢(endospore)蛋白質懸浮芯片的制備方法及其定量檢測方法。

背景技術

炭疽芽孢桿菌(Bacillus?anthracis)是引起人獸共患病-炭疽的病原菌，為革蘭氏陽性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通過呼吸道、消化道、皮膚接觸感染人類，一般在接觸后7天出現感染癥狀，以皮膚型炭疽最常見。吸入大量炭疽芽孢(大于8000個)可引起吸入型炭疽，也稱肺炭疽。由于炭疽芽孢具有對外界環境極強的抵抗力，致污染可持續存在，在軍事上一直被列為是頭號生物戰劑之一。在一些國家曾生產并作為武器儲存，而今又成為恐怖襲擊選用劑，對人類造成新的更大的威脅。炭疽芽孢桿菌的抗原包括菌體抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢桿菌的生存、增殖不需特殊條件設備及環境，在土壤中就可增殖，人工大量培養及使之變為芽孢十分容易。由于芽孢獨特的生物學性狀和危害，對炭疽芽孢的快速定量檢測意義重大。

出于公共衛生和國家安全的目的，研究和開發快速、定性、定量檢測傳染病病原體是所屬技術領域中長期致力追求的目標。尤其對于炭疽菌來說，作為一種烈性傳染病的病原體，能否實現定量檢測至關重要。目前用于炭疽菌的實驗室常規檢測方法有細菌學檢測方法、血清學檢測方法及檢測核酸的分子生物學方法。但是，細菌學檢測方法、血清學檢測方法(例如間接血凝方法)及核酸檢測法等現有檢測技術存在許多缺陷。對于細菌學檢測法，細菌培養耗時較長，不適合對炭疽菌的快速檢測。對于核酸檢測法，盡管采用了PCR技術對炭疽菌進行檢測和分析特異性高，不容易被污染，但是現有PCR技術的方法繁瑣，特別是此類方法包括DNA/RNA的提取和復雜的操作步驟，而且不能用于非核酸物質如蛋白質的檢測，因此核酸檢測法具有局限性且不方便。新近發展的免疫學檢測方法生物傳感器技術，如光纖傳感器、電化學傳感器、上轉換磷光生物傳感器、納米傳感器等以抗體檢測報道較多，抗原直接檢測的報道較少。本發明選擇炭疽芽孢作為產芽孢的細菌及其芽孢的代表建立蛋白質懸浮芯片檢測模型。

懸浮芯片(suspension?array)也稱液相芯片(liquid?array，liquidchip)，是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應后，利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發微球基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的微球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數十種病原。懸浮芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。

目前發展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優化，以縮短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測炭疽及其芽孢，是否適合從粉末、液體等樣品中快速直接檢測，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發明內容

本發明的目的是提供一種炭疽芽孢桿菌(Bacillus?anthracis)芽孢的蛋白質懸浮芯片，同時還提供基于該芯片的炭疽芽孢桿菌芽孢的定量檢測方法。

本發明技術方案如下：