[發明專利]一種蓖麻毒素的蛋白質懸浮芯片制備及定量檢測方法

無效

• 申請號: 200910080254.8
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101545905A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 王靜;王景林;楊宇;孫肖紅;胡孔新
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/546;G01N21/76
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種蓖麻毒素(ricin)的蛋白質懸浮芯片制備及定量檢測方法。

背景技術

蓖麻毒素(ricin?toxin，以下簡稱ricin)是蓖麻籽中含有的一種高毒性的糖蛋白，由A、B多肽鏈靠二硫鍵組成的異二聚體，A鏈為效應鏈，具有RNA?N-糖苷酶活性，可使核糖體失活；B鏈為結合鏈，含有兩個半乳糖結合位點，介導A鏈進入細胞內發揮毒性作用。蓖麻毒素經呼吸道吸入、消化道攝入和肌肉注射均可致人中毒。人經口致死量0.15-0.2g，靜脈注射致死量20mg，小鼠腹腔LD50約為3.0μg/kg。蓖麻毒素毒性大，性質穩定，來源較廣，提取成本低廉。隨著多個恐怖組織和極端分子研制和使用蓖麻毒素的消息接連進入媒體，這種致命的、毒性極強的生物毒素被美國等國列為最有可能被用做恐怖襲擊的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速偵檢方面，美國、歐盟等國家一直十分重視，已建立了供實驗室和現場使用的方法：如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、化學分析技術、生物傳感器技術以及膠體金免疫層析方法等；我國臺灣地區也建立了檢測蓖麻毒素的ELISA和膠體金免疫層析方法及其配套診斷試劑。建立蓖麻毒素的快速定量試劑具有重要現實意義。同時，本發明選擇蓖麻毒素作為植物毒素的代表建立檢測模型。

懸浮芯片(suspension?array)也稱液相芯片(liquid?array，liquidchip)，是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應后，利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發微球基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的微球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數十種病原。懸浮芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。

目前發展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優化，以縮短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測植物毒素例如蓖麻毒素，是否適合從粉末、液體等樣品中快速直接檢測，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發明內容

本發明的目的是提供一種蓖麻毒素(ricin)的蛋白質懸浮芯片，同時還提供基于該芯片的蓖麻毒素的定量檢測方法。

本發明的技術方案具體如下：

一種檢測蓖麻毒素蛋白質懸浮芯片，該懸浮芯片包括：編碼微球(例如027號)，包被微球的蓖麻毒素的捕獲抗體(例如兔抗蓖麻毒素A抗體)、生物素標記的蓖麻毒素檢測抗體(例如蓖麻毒素單抗RAC)、鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)及相關緩沖溶液。

一種蓖麻毒素的蛋白質懸浮芯片檢測方法，檢測過程中全部反應可在96孔濾板上進行也可在微量離心管中進行，包括下列步驟：(1)每孔加入含已包被捕獲抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入檢測樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化檢測抗體，孵育后清洗；(4)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入檢測緩沖液后混勻，(6)用懸浮芯片系統讀取FMI數值(平均熒光強度)并分析數據判定檢測結果陰性或陽性。