[發明專利]一種系統置換的多重基因擴增技術

無效

• 申請號: 200910079440.X
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101831491A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 江洪;廖同兵;張輝;徐雪;江必勝
• 申請（專利權）人: 北京泰格瑞分子檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于分子生物學技術領域及分子檢測應用領域，涉及一種靶基因擴增置換為報告序列擴增的間接聚合酶鏈反應(Polymerase?Chain?Reaction)及其檢測應用。

背景技術：

聚合酶鏈反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是二十世紀80年代中后期發展起來的體外核酸擴增技術。它能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于一、二小時內擴增至一百萬倍以上，使肉眼能在凝膠上直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾周至幾個月才能克隆得到的一個目的基因，現在用PCR幾小時便可完成。

核酸研究歷經100多年的探索，從1953年Watson和Crick建立了DNA雙螺旋結構模型后，開啟了核酸的分子生物學研究時代。由于各種DNA僅編碼遺傳信息不同，而理化性能一樣，所以微量DNA難以通過理化技術分離純化及特異性檢測。二十世紀70、80年代開發出了基于細菌單克隆篩選基因文庫及轉化基因的分子克隆技術，但是操作繁瑣、耗時。Korana早在1971年就提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實現和“鏈式反應”名稱源于美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary?Mullis在1983年的一次靈感：于試管中模擬天然的DNA體內復制過程。提供一種合適的條件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。

PCR反應由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：擬擴增的模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，不斷重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～3分鐘，??2～3小時就能將待擴目的基因呈指數擴增放大百萬倍以上。反應最終的DNA擴增量可用Y＝(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100％，但在實際反應中平均效率達不到理論值。??反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，??即出現“停滯效應”--平臺期。Mullis經過兩年的研究證實了這一技術，申請了首個PCR發明專利(US?Patent?4,683,202)。