[發(fā)明專(zhuān)利]一種系統(tǒng)置換的多重基因擴(kuò)增技術(shù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910079440.X
• 申請(qǐng)日: 2009-03-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101831491A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江洪;廖同兵;張輝;徐雪;江必勝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京泰格瑞分子檢驗(yàn)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.“一種系統(tǒng)置換的多重基因擴(kuò)增技術(shù)”，其特征是將靶基因DNA/RNA置換成與靶種系不同源的報(bào)告基因序列，再擴(kuò)增報(bào)告系統(tǒng)間接指示靶分子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，系統(tǒng)置換特征在于待測(cè)模板靶DNA/RNA通過(guò)預(yù)選特異性的短探針雜交區(qū)分成兩小段相鄰序列合成短模板區(qū)擴(kuò)增引物，同時(shí)將一段與靶不同源的長(zhǎng)報(bào)告基因分成左右部份分別加在短模板區(qū)擴(kuò)增引物5’端前面。帶報(bào)告基因的短模板區(qū)引物擴(kuò)增短模板時(shí)就帶上了長(zhǎng)報(bào)告基因序列，再用報(bào)告序列引物擴(kuò)增中間帶探針的長(zhǎng)報(bào)告基因，兩步指數(shù)式擴(kuò)增間接放大指示靶分子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，其特征在于一種至N種待測(cè)靶基因系統(tǒng)置換成帶一至N種不同探針的與靶不同源的同一報(bào)告序列系統(tǒng)，同一報(bào)告序列PCR擴(kuò)增、同時(shí)指示多重靶分子。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，其特征在于一種至N種靶基因每種選取另外2、3……n段特異雜交區(qū)并相應(yīng)置換成帶一至N種不同探針的另外報(bào)告序列2、3……，一套工作時(shí)污染了就換一套輪換使用。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述預(yù)選特異性的短探針雜交區(qū)指靶基因特異性的、最保守的短遺傳序列，長(zhǎng)度為30-100base。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述預(yù)選特異性的短探針雜交區(qū)長(zhǎng)度優(yōu)選為40-60base。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述與靶種系不同源的報(bào)告基因序列指與靶基因同源性最小的、非特異性雜交最少的核酸序列、人造修飾核酸。其長(zhǎng)度為50-1000base。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述與靶種系不同源的報(bào)告基因序列長(zhǎng)度優(yōu)選為100-500base。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述兩步指數(shù)式擴(kuò)增指靶置換擴(kuò)增和報(bào)告系統(tǒng)擴(kuò)增分兩步PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件與常規(guī)PCR相同，也可兩步合并。所述擴(kuò)增采用的耐熱聚合酶指Taq、Tth、pfu、Vent等耐熱聚合酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)置換擴(kuò)增技術(shù)，所述兩步指數(shù)式擴(kuò)增合并是指兩步的退火溫度差10℃以上時(shí)，兩步合并于單管反應(yīng)。所述擴(kuò)增采用的耐熱聚合酶優(yōu)選熱啟動(dòng)聚合酶。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“一種系統(tǒng)置換的多重基因擴(kuò)增技術(shù)”，一樣適用于所有常規(guī)PCR應(yīng)用領(lǐng)域，實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time?PCR)檢測(cè)，PCR產(chǎn)物生物芯片(Micro-Array，微陣列)分析，分子組化，分子病理原位PCR。

12.一種帶靶探針的報(bào)告基因序列，其特征是指一對(duì)與靶不同源的報(bào)告序列末端與靶探針序列首端重組的單鏈核酸。使用化學(xué)合成、不對(duì)稱PCR、M₁₃質(zhì)粒、固相分離方法生產(chǎn)。一對(duì)該報(bào)告序列以一端探針引物與靶基因結(jié)合、延伸，置換為帶靶探針的報(bào)告系統(tǒng)，報(bào)告系統(tǒng)再擴(kuò)增間接指示靶分子。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述系統(tǒng)置換擴(kuò)增的一種帶靶探針的報(bào)告基因序列單鏈可以是修飾堿基、類(lèi)似堿基組成的人造核酸序列，采用各種理化方法小規(guī)模制備和工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)。

14.所述系統(tǒng)置換的多重基因擴(kuò)增試劑盒成份包括：樣本核酸提取試劑，帶探針報(bào)告序列核酸，10mM?dNTPs，Taq、Tth聚合酶及其緩沖液，熒光染料、熒光探針，報(bào)告系統(tǒng)引物F/R，凝膠電泳試劑和Oligos雜交芯片。