[發明專利]制備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法

有效

• 申請號: 200910079258.4
• 申請日: 2009-03-05
• 公開（公告）號: CN101497909A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發明（設計）人: 孫志偉;余云舟;俞煒源;杜韞;林建波
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K16/12;C12R1/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種制備抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗體的方法。

背景技術

肉毒毒素(Botulinum?Toxin，BoNT)是目前已知毒力最強的蛋白，1.0g肉毒毒 素結晶物足以殺死100萬人，由肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)在厭氧環境中 產生的外毒素有7個血清型(A-G)，其中，A、B型肉毒毒素是致人中毒的常見型，E、 F型偶爾引起食物中毒流行，C、D型則僅引起動物、禽類中毒，G型引起中毒的報 道較少。臨床觀察表明，A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴重的中毒癥狀，并導 致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中發病機率小，但其毒性大，致死率高，對 公共衛生安全危害極大，必須引起人們的高度重視。由于產生肉毒毒素的肉毒梭菌 在自然界廣泛存在，并且其芽孢對外界環境具有較強的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然 是一個十分嚴重的公共衛生問題。近年，我國許多地區均發生數例肉毒中毒的疫情， 甚至有群體肉毒毒素中毒事件發生。尤其是A型肉毒毒素還被數十個國家(如前蘇 聯和伊拉克)用于制造生物武器，同時其也可被恐怖組織利用以制造生物恐怖。因 此，進行肉毒毒素的防治研究無論是對國家生物安全，公共衛生安全，還是 對人們群眾的生命健康安全都具有重要的實際意義。

對于肉毒毒素中毒的預防，現有的疫苗為類毒素(PBT)疫苗，存在工藝復雜、 副作用大、保護性不好、免疫周期長，未能獲得FDA批準。我國目前也尚無有效的 疫苗，因此肉毒毒素中毒治療藥物的研究就顯得尤為重要。中毒治療藥物的研究主 要集中在中和抗體和毒素拮抗劑，其中中和抗體是最有效的治療藥物。中和抗體可 分為多克隆抗毒素和單克隆抗體。目前國際上基因工程中和單抗的研究均處于實驗 室階段。因此，盡管多克隆抗毒素可能存在過敏、動物病毒污染等問題，但仍是目 前肉毒毒素中毒治療藥物的最佳選擇。目前，一些發達國家均有肉毒毒素抗毒素產 品上市。我國蘭州生物制品研究所研制的A、B、C、D、E、F?6個血清型的單價抗 毒素也均已通過SFDA認證上市。然而世界各國肉毒毒素抗毒素的儲備嚴重不足， 為了應對在泰國爆發的肉毒毒素中毒事件，分別從四個國家(美國、英國、加拿大 和日本)緊急調集抗毒素才避免了中毒人員的死亡就說明了這個問題。

國際上和國內肉毒毒素抗毒素(抗肉毒毒素免疫球蛋白抗體)均是采用類毒 素免疫動物而制備的。類毒素的一些表位，尤其對抗體識別與中和作用至關重要的 表位可能在毒素滅活過程中發生改變，無論是作為免疫原或是抗原，類毒素與毒素 之間都存在顯著差異。同時，類毒素本身還存在過多的非中和表位，導致免疫產生 的抗體雖然滴度可以很高，但有效成分中和抗體的比例較低，即比活性相對較低， 抗毒素的中和活性受到影響，而衡量抗毒素藥效的最重要指標為中和抗體的活性 (比活性)。因此，一個理想的免疫原應該是保持其自身結構的最小的非毒性部分， 能產生完全的免疫保護，同時缺乏整個毒素的生物學特性。肉毒毒素保護性抗原為 重鏈受體結合區(Hc)，它包含保護性抗原基本決定簇(PPADs)，在動物體內能夠 誘發中和抗體，對于毒素的攻擊具有保護效果。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種制備A型肉毒毒素免疫原的方法。

本發明所提供的制備A型肉毒毒素免疫原的方法，包括如下步驟：

1)將序列表中序列1所示基因轉入宿主菌中，得到含有所述基因的重組菌；

2)發酵步驟1)得到的重組菌，得到含有A型肉毒毒素免疫原的產物；

3)將步驟2)得到的產物進行陽離子交換層析，得到一次純化產物；

4)將步驟3)得到的一次純化產物進行陰離子交換層析，得到二次純化產物；

5)將步驟4)得到的二次純化產物進行疏水層析，得到A型肉毒毒素免疫原。

其中，所述陽離子交換層析使用SP陽離子交換柱，所用的洗脫緩沖液為含300mM NaCl、pH值為7.4的20mM磷酸鈉溶液。

所述陰離子交換層析中使用Q陰離子交換層析柱；所述疏水層析使用辛基HIC 疏水層析柱，所用的洗脫緩沖液為含50mM?NaCl的20mM磷酸鈉溶液。

所述基因是通過重組表達載體pTIG-Trx-AHc轉入所述宿主菌中的；

所述重組表達載體pTIG-Trx-AHc是通過將序列表中序列1所示基因插入原核 表達載體pTIG-Trx的EcoR?I和Xho?I位點得到的；