[發明專利]一種可定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白質懸浮芯片方法

無效

• 申請號: 200910078819.9
• 申請日: 2009-03-04
• 公開（公告）號: CN101493468A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 王靜;孫肖紅;楊宇;張曉龍;胡孔新
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/546
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

1、一種采用雙抗體夾心免疫學檢測模式檢測鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)的方法，其特征在于，檢測過程中全部反應可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟：

(1)向孔加入含已包被抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(2)加入待測樣品，孵育后清洗；

(3)加入用生物素化的檢測抗體，孵育后清洗；

(4)加入SA-PE，孵育后清洗；

(5)加入檢測緩沖液后混勻；

(6)用懸浮芯片系統讀取平均熒光強度(FMI)數值并分析數據。

2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，用于包被微球的抗體選自以下中的一種或多種抗體：(1)兔抗鼠疫菌EV76抗體；(2)羊抗鼠疫菌EV76抗體；(3)兔抗鼠疫菌F1抗原的抗體；(4)鼠抗鼠疫菌F1抗原的IgG，單抗2F6、5G12、2H12；(5)羊抗鼠抗體；(6)雞IgG；(7)兔抗雞IgG。

3、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的抗體及其用量選自：16μg單抗5G12、24μg單抗2H12和16μg兔抗EV76、10μg羊抗EV76以及10μg、40μg的兔抗體中的一種或多種。

4、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化的檢測抗體選自生物素化的鼠疫菌F1單抗2F6、5G12、2H12。

5、如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用微球標記的兔抗F1為捕獲抗體，采用生物素標記的單抗2F6作為檢測抗體，其組合。

6、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的生物素為羧基活性的生物素。

7、如權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟：

1)向普通ELISA微孔板每孔加入用PB緩沖液稀釋的捕獲抗體，靜止過夜；加入封閉液封閉；

2)加入檢測樣品，室溫放置，洗滌；

3)加入生物素化檢測抗體，室溫放置，洗滌；

6)加入適量辣根酶標記鏈霉親和素，室溫放置，洗滌；

7)加入TMB顯色液，即可溶型單組分TMB底物溶液顯色，室溫放置；

8)用2M?H₂S0₄終止反應；應用酶標儀測讀A_450nm數值。

8、一種定量檢測鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)的蛋白質懸浮芯片方法，其特征在于，該方法包括下列步驟：

(1)加入的陽性檢測樣品或標準品經梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋為2倍、4倍、5倍或10倍；

(2)制作樣品濃度對應FMI值的劑量-反應曲線；

(3)用分析軟件擬合劑量-反應曲線和方程；

(4)未知濃度樣品可根據劑量-反應曲線和方程判斷樣品檢測濃度，可判定方法檢測限。

9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，在測定待測樣品的FMI數值時包括以下的步驟：

1)加入含相應編碼微球的工作溶液，洗滌；

2)加入待測樣品，混勻后室溫避光震搖，洗滌；

3)加入適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖，洗滌；

4)加入辣根酶標記鏈霉親和素，室溫避光震搖，洗滌；

5)加入的檢測緩沖液，經VOTEX重懸混勻，用Bio-Plex懸浮芯片系統讀取FMI數值并分析數據。

10、如權利要求8所述的方法，其特征在于，用于包被微球的抗體選自以下中的一種或多種抗體：(1)兔抗鼠疫菌EV76抗體；(2)羊抗鼠疫菌EV76抗體；(3)兔抗鼠疫菌F1抗原的抗體；(4)鼠抗鼠疫菌F1抗原的IgG，單抗2F6、5G12、2H12；(5)羊抗鼠抗體；(6)雞IgG；(7)兔抗雞IgG。

11、如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的抗體及其用量選自：16μg單抗5G12、24μg單抗2H12和16μg兔抗EV76、10μg羊抗EV76以及10μg、40μg的兔抗體。

12、如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物素化的檢測抗體選自生物素化的鼠疫菌F1單抗2F6、5G12、2H12中的一種或多種。