[發明專利]以卵裂后的發育胚胎替代卵母細胞的治療性克隆新方法

有效

• 申請號: 200910077408.8
• 申請日: 2009-02-09
• 公開（公告）號: CN101798569A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發明（設計）人: 周琪;阿姆賈德·里亞茲;趙小陽;李偉;于洋;王柳
• 申請（專利權）人: 北京華盛興邦生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/06
• 分類號: C12N15/06;C12N5/16;C12N15/00;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 李丙林;張英

技術領域

本發明涉及一種獲得小鼠核移植受體的方法，使用所述小鼠核 移植受體獲得小鼠胚胎干細胞的方法，以及使用該小鼠核移植受體 獲得克隆小鼠的方法。本發明還涉及一種治療性克隆新方法，其中， 以卵裂后的發育胚胎替代卵母細胞作為核移植受體。

背景技術

隨著環境惡化、人類年齡延長、農藥和抗生素的濫用，人類各 種疑難病越來越多，胚胎干細胞(ES細胞)為解決上述問題提供很多 機遇，胚胎干細胞因其具有在體外可無限增殖，在一定條件下又可 以向某一方向誘導分化的特點，為治療和修復人類身體的組織提供 了誘人的應用前景和巨大的商業潛值。

1997年克隆羊多莉誕生，1998年人類成功建立人胚胎干細胞 系，人們開始思索將核移植和胚胎干細胞這兩項振奮人心的技術結 合起來，提出了治療性克隆技術。利用核移植技術可以生產用于組 織和細胞替代治療的人類胚胎細胞，干細胞定向分化為特定的組織 類型，來替代那些受損的體內組織。把患者體細胞移植到去核卵母 細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養到囊胚，然后從囊胚內分離 出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型(如 神經細胞、肌肉細胞和血細胞)，用于替代療法。這種核移植法得 到的干細胞和分化細胞由于與供體細胞同源，因此在組織和細胞替 代治療中不會發生免疫排斥。然而，由于作為重編程受體的人卵母 細胞的稀缺，使治療性克隆的應用受到了限制。

自二十世紀中葉人們認為相對于卵母細胞，受精卵以及早期胚 胎幾乎沒有重編程能力；但2007年Nature報道了受精卵可以重編 程體細胞核并獲得克隆動物徹底改變了之前人們的觀點。受精卵也 可以重編程體細胞獲得克隆胚胎干細胞系。但受精卵的來源依然有 限，而據最新研究發現，世界范圍內在各IVF中心有大量的凍存的 早期廢棄胚胎。如果這些胚胎能用于治療性克隆，就可以大大緩解 重編程受體不足的狀況。

關于核移植技術的發展過程，可通過以下描述而獲知：

早在1958年Gurdon等人將爪蟾分化細胞的核物質移植到去核 卵母細胞中即獲得了克隆動物(Gurdon?et?al.，1958)，從而推翻了之 前被廣泛接受的分化狀態不可逆轉的假說(Briggs?and?King，1952)。 之后，McGrath和Solter等通過受精卵原核互換可得到到期小鼠的 實驗(受精卵為供體)，證明在哺乳動物中同樣可以獲得克隆動物 (McGrath?and?Solter，1983)。同時，對于分化細胞的細胞核，他們 試圖用間期去核受精卵作為受體對其進行重編程，卻不具備這樣的 能力(McGrath?and?Solter，1984)。然而，與合子細胞質不同的是， MII期卵母細胞的細胞質具有重編程分化細胞核的能力。迄今為止， 已經獲得了12個物種的克隆動物(Baguisi?et?al.，1999；Chesne?et?al.， 2002；Galli?et?al.，2003；Kato?et?al.，1998；Lee?et?al.，2005；Li?et?al.， 2006；Polejaeva?et?al.，2000；Shin?et?al.，2002；Wakayama?et?al.，1998； Wilmut?et?al.，1997；Woods?et?al.，2003；Zhou?et?al.，2003)。在此期間， Wakayama等也曾重新評估合子細胞質的重編程能力，得到了否定 的結論(Wakayama?et?al.，2000)，為Solter的觀點提供了佐證(Solter， 1999)。然而，2006年Eggan等證明中期的小鼠受精卵胞質具有重 編程的能力(Greda?et?al.，2006)。最近，Egli等進一步證實了Eggan 等人的實驗結果，同時認為重編程因子存在于核中，只有核膜破裂 的中期受精卵才具有重編程能力(Egli，et?al，2007)。

如上所述，目前，成熟卵母細胞和受精卵是唯一可以獲得體細 胞來源克隆胚胎干細胞和克隆動物的核移植受體。但是作為克隆技 術中發揮重編程作用的受體——卵母細胞的獲得受到諸多限制，同 時面臨醫學、倫理學等問題。利用受精卵作為受體為治療性克隆開 辟了一個新的思路，但其來源依然有限。如果其他發育階段的植入 前胚胎也具有重編程能力的話，就可以大大增加克隆受體來源的途 徑。