[發明專利]一種蛋白質復合物或復合體的三維凝膠電泳分離方法

無效

• 申請號: 200910076496.X
• 申請日: 2009-01-05
• 公開（公告）號: CN101768207A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 陳國強;李智立
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C07K1/26
• 分類號: C07K1/26
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種蛋白質復合物或復合體的三維凝膠電泳分離方法。

背景技術

蛋白質復合物或復合體三維凝膠電泳(three-dimensional?gel?electrophoresis，3-DE)技術最早由Wolf?Werhahn等人提出(Werhahn，W.，Braun，H.P.，Electrophoresis?2002，23，640-646)，它是指將蛋白質混合物先進行藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(bluenative?polyacrylamide?gel?electrophoresis，BN-PAGE)或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native?polyacrylamide?gel?electrophoresis，native-PAGE)方法分離，再進行常規二維凝膠電泳(two-dimensional?gel?electrophoresis，2-DE)方法分離。其具體方法是將線粒體中的蛋白質混合物先進行藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分離，切下含目標蛋白質復合物或復合體的凝膠條帶，再進行蛋白質電洗脫和蛋白質沉淀以回收膠內蛋白質，將回收的蛋白質用常規二維凝膠電泳方法進行分離，從而得到了目標蛋白質復合物或復合體的亞基分布圖。該三維凝膠電泳分離技術充分整合了藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法的簡便、經濟、電泳條件溫和的特點和二維凝膠電泳方法高分辨率的優點，使其能夠有效地分離大部分的蛋白質復合物或復合體，即使該蛋白質復合物或復合體存在于復雜生物樣本中，如細胞或組織粗提液(Wittig，I.，Braun，H.P.，Schagger，H.，Nature?Protocol?2006，1，418-428)。

然而，該方法的主要缺點是蛋白質電洗脫和蛋白質沉淀操作過程比較繁瑣，還需要專門的蛋白質電洗脫設備，且此過程將不可避免地造成蛋白質損失，并容易發生蛋白質體外化學修飾；同時由于蛋白質復合物或復合體中各亞基的溶解性可能存在較大差異，將導致各亞基回收量不一致，最終導致所分析的蛋白質復合物或復合體中各亞基化學計量數不準確。因此，需要建立一種無需經過蛋白質電洗脫和蛋白質沉淀過程的蛋白質復合物或復合體的三維凝膠電泳分離方法，以便獲得生物體內的真實的生命信息。

發明內容

本發明的目的是提供一種無需經過蛋白質電洗脫和蛋白質沉淀過程的蛋白質復合物或復合體的三維凝膠電泳分離方法。

本發明所提供的蛋白質復合物或復合體的三維凝膠電泳分離方法，包括下述步驟：

1)將蛋白質混合物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分離，然后將其染色。

2)切下步驟1)中得到的含目標蛋白質復合物或復合體的凝膠條帶，并將其脫色和脫水。

3)用蛋白質變性溶液浸泡步驟2)中處理過的凝膠條帶，將其充分碾碎后直接進行二維凝膠電泳方法分離。

所述步驟1)中，所述電泳分離方法為采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分離蛋白質混合物，然后將其染色。

所述步驟2)中，所述脫色為用含25mM碳酸氫銨和50％(體積分數)乙腈的溶液浸泡沖洗所述含目標蛋白質復合物或復合體的凝膠條帶。

所述步驟2)中，所述脫水為用脫水劑浸泡所述含目標蛋白質復合物或復合體的凝膠條帶，然后使脫水劑揮發；或者采用真空離心干燥的方法，將膠內水分完全揮發。所述脫水劑可為甲醇、乙醇、丙酮或乙腈，優選乙腈，乙腈的優點是脫水速度明顯比其他脫水劑快。

所述步驟3)中，所述蛋白質變性溶液為含7M尿素、2M硫脲和0.02g/ml3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽的溶液。

所述步驟3)中，所述用于浸泡凝膠的蛋白質變性溶液的用量不僅包括能使第一維等電聚焦電泳方法所用的固相pH梯度膠條充分水化的體積量，還包括被凝膠吸脹的體積量。能使第一維等電聚焦電泳方法所用的固相pH梯度膠條充分水化的蛋白質變性溶液推薦體積量可以根據所用的固相pH梯度膠條的長度來確定；被凝膠吸脹的蛋白質變性溶液體積量一般為每個凝膠條帶20μl。所以，除了加入能使第一維等電聚焦電泳方法所用的固相pH梯度膠條充分水化的體積量外，還應根據凝膠條帶的個數補加相應體積量的蛋白質變性溶液，避免由于固相pH梯度膠條未能充分水化而導致第一維等電聚焦電泳方法分離效果不好。

所述步驟3)中，所述碾碎后的凝膠直接進行二維凝膠電泳方法中的第一維等電聚焦電泳(isoelectric?focusing，IEF)方法分離。