[發明專利]中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列、構建方法及其氨基酸序列和用途

無效

• 申請號: 200910076366.6
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101775401A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 陶鳳云;趙偉
• 申請（專利權）人: 北京聯合大學生物化學工程學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/63;A61K38/46;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及一種中國林蛙功能序列及其編碼的蛋白序列，具體地說是一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列及其編碼的氨基酸序列和其用途。

背景技術

全世界每年新診斷的癌癥病例達1億，每10萬人中250人死于癌癥，因此戰勝癌癥是現代醫藥最重大的挑戰之一。盡管外科手術可以治愈可切除的癌癥，不可切除的癌癥只能采用化學治療或放射治療。常規藥物用于治療存在的主要問題是，缺乏選擇性，毒性強烈及外來蛋白的免疫原性，經常會導致副反應，如暫時性腹瀉、惡心、脫發、易感染。有時會對心、肺、腎、骨髓產生長期影響。

大多數降解DNA的藥物所導致的凋亡與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否關系密切，在p53缺失的情況下，降解DNA的藥物對腫瘤無效。目前人類的大部分腫瘤(尤其是實質性腫瘤)都能通過變異使p53失活，或產生p53抗體。而且，導致DNA損傷的藥物往往能夠使正常細胞產生基因變異。

因此需要開發毒性適度的、人類具有免疫耐受性的藥物來解決這些問題。

RNases能夠降解RNA引起細胞死亡，被認為是一種毒素。活細胞大約含有20種外切和內切核糖核酸酶，把RNA處理為成熟形式并調控RNA轉錄。RNase參與RNA代謝、細胞成熟、細胞生理死亡、促進血管生成，而且發揮抵御RNA病毒的宿主防御功能。

當外源RNases進入細胞，它們可能通過降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋亡而殺死細胞。

實際上，已經發現多種核糖核酸酶在體外實驗中具有細胞毒性，但在體內實驗中卻毫無毒性。該家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase?A)，由于受到哺乳動物體內普遍存在的核糖核酸酶抑制劑(RI)的作用，不具備抗腫瘤作用。而從牛精液中發現的天然二聚體形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，盡管與RNase?A的氨基酸序列相似性高達80％，但是不受RI的抑制作用，在體內外實驗中均顯示出強大的選擇性地抗腫瘤作用。BS-RNase不僅作用于腫瘤細胞，還具有胚胎毒性，精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是來源于嗜酸性粒細胞的核糖核酸酶A超家族成員，盡管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP主要表現出強大的殺菌、殺寄生蟲的功能。從家雞(Gallus?gallus)白細胞中分離到兩種核糖核酸酶RNases?A-1和A-2，二者具有81％氨基酸序列相同，二者都與人血漿核糖核酸酶抑制劑(hRI)相互作用。RNases?A-2同時具有血管生成活性和殺菌作用，RNases?A-1沒有這兩種活性。目前的研究發現，核糖核酸酶A超家族成員是一組快速進化的蛋白家族，不同的物種中核糖核酸酶序列的微小差異導致功能的顯著變化。

目前文獻報道的蛙類核糖核酸酶抗腫瘤的研究，僅局限于豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。不同蛙物種核糖核酸酶的氨基酸序列不同，結構的差異導致功能不同。

在兩棲動物蛙屬中，最早被鑒定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt等從R.pipiens卵中基于其抗腫瘤作用而分離的蛋白。Onconase完整氨基酸順序的闡明，揭示出其屬于核糖核酸酶A超家族。另外三種核糖核酸酶從蛙的卵和肝被鑒定：牛蛙Rana?catesbeiana(蛙卵rc-RNase，蛙肝rc-L1)日本稻田蛙Ranajaponica(蛙卵rj-lec)。1998年Huang等首先分離出編碼蛙核糖核酸酶的cDNA，發現mRNA僅在雌蛙的肝臟表達，最終合成的蛋白定位于蛙卵細胞中。2000年Liao等從蛙卵黃顆粒提取物和肝中分離出5個編碼牛蛙R.catesbeiana核糖核酸酶的cDNA序列(rc-01編碼rc-L1，rc-02，rc-03，rc-04，rc-06)，2000年Chen等從r.pipiens中發現了性別特異性的細胞毒性核糖核酸酶(rp-rap)。2001年Rosenberg等以牛蛙Rana?catesbeiana基因組DNA為模板，采用PCR得到了五個新的蛙核糖核酸酶基因順序(rc-203，rc-204，rc-208，rc-212，rc-218)。表明來源于蛙屬的核糖核酸酶基因通過正向選擇快速分化的方式進化，暗示了這個獨特的蛋白家族可能具有新的生理功能。

以核糖核酸酶A為代表的大多數嘧啶堿基特異性核糖核酸酶具有四個分子內的二硫鍵，而且其位置非常保守。蛙蛋白保留了核糖核酸酶A四個二硫鍵中的三個，在靠近C端出現一個新的二硫鍵。盡管與RNase?A具有相似的三維結構，來源于兩棲動物的RNases在體外實驗中不受人RI抑制，這歸因于其與RNase?A的序列相似性低。進化地位更低的魚類卻受到RI抑制。