[發(fā)明專利]中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列、構(gòu)建方法及其氨基酸序列和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910076366.6
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101775401A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陶鳳云;趙偉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/63;A61K38/46;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

1.一種中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3，其特征在于，其核苷酸序列為序列表中SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

2.一種中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3所編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列為序列表SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3的構(gòu)建方法，其特征在于，其具體步驟為：提取出中國林蛙的基因組DNA，設(shè)計基因特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳，所述的基因特異性引物為序列表中SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的核苷酸，為正反引物對：

正向引物N275：TAT?TTG?CAG?TTG?TTT?TGA?GTC?TCA?C

反向引物C715：CTG?CTT?ATC?ACA?TCC?CTG?TTG?TC

從電泳膠中回收目標(biāo)DNA片段，與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR初步鑒定目標(biāo)基因后，測序。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3的構(gòu)建方法，其特征在于，所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增步驟的PCR反應(yīng)體系及參數(shù)：

基因組DNA、dNTPs、H₂O、10×Taq?Buffer、Taq?DNA?Polymerase和基因特異性引物至總體積50μl，混合均勻；

擴(kuò)增條件為：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃延伸7min結(jié)束。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3的構(gòu)建方法，其特征在于，所述與質(zhì)粒連接的具體步驟為：

(1)目標(biāo)DNA片斷、載體、T4?DNA?Ligase、10×T4?DNA?Ligase?Buffer至總體積10μl；

(2)16℃連接10～12小時制備成連接好目標(biāo)基因的載體；

(3)對步驟(2)連接好的樣品進(jìn)行PCR檢測；連接產(chǎn)物1μl、dNTPs、10×Taq?Buffer?5μ1、Taq?DNA?Polymerase3U和質(zhì)粒通用引物各10pmol，補(bǔ)無菌超純水至總體積50μl，混合均勻；PCR擴(kuò)增條件：94℃30s，48℃?30s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃延伸7min結(jié)束；

(4)2.5％TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3的構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的具體步驟為：

(1)將5μl目標(biāo)基因與質(zhì)粒連接的產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min；

(2)42℃水浴中熱激90s；取出后立即置于冰浴2min；

(3)加入500μl提前37℃預(yù)熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，150rpm搖床培養(yǎng)45min；

(4)4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100μl涂轉(zhuǎn)化平板，涂勻，干燥，倒置平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)16h；

(5)挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床37℃、180rpm培養(yǎng)12h。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNase3的構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR初步鑒定目標(biāo)基因步驟的PCR反應(yīng)體系及參數(shù)為：

提取的重組質(zhì)粒、dNTPs、10×Taq?Buffer、H₂O、Taq?DNA?Polymerase和引物至總體積20μl，混合均勻；

PCR擴(kuò)增條件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃延伸7min結(jié)束。

8.一種權(quán)利要求1所述的中國林蛙(Rana?dybowskii)功能基因Rd-RNa7se3在制備治療抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。?