[發明專利]中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列、構建方法及其氨基酸序列和用途

無效

• 申請號: 200910076365.1
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101775400A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 趙偉;陶鳳云
• 申請（專利權）人: 北京聯合大學生物化學工程學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/63;A61K38/46;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及一種中國林蛙功能序列及其編碼的蛋白序列，具體地說是一種中 國林蛙功能基因Rd-RNase2序列及其編碼的氨基酸序列和其用途。

背景技術

全世界每年新診斷的癌癥病例達1億，每10萬人中250人死于癌癥，因此戰勝 癌癥是現代醫藥最重大的挑戰之一。盡管外科手術可以治愈可切除的癌癥，不可 切除的癌癥只能采用化學治療或放射治療。常規藥物用于治療存在的主要問題 是，缺乏選擇性，毒性強烈及外來蛋白的免疫原性，經常會導致副反應，如暫時 性腹瀉、惡心、脫發、易感染。有時會對心、肺、腎、骨髓產生長期影響。

大多數降解DNA的藥物所導致的凋亡與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否 關系密切，在p53缺失的情況下，降解DNA的藥物對腫瘤無效。目前人類的大部 分腫瘤(尤其是實質性腫瘤)都能通過變異使p53失活，或產生p53抗體。而且， 導致DNA損傷的藥物往往能夠使正常細胞產生基因變異。

因此需要開發毒性適度的、人類具有免疫耐受性的藥物來解決這些問題。

RNases能夠降解RNA引起細胞死亡，被認為是一種毒素。活細胞大約含有20種 外切和內切核糖核酸酶，把RNA處理為成熟形式并調控RNA轉錄。RNase參與RNA代 謝、細胞成熟、細胞生理死亡、促進血管生成，而且發揮抵御RNA病毒的宿主防 御功能。

當外源RNases進入細胞，它們可能通過降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋 亡而殺死細胞。

實際上，已經發現多種核糖核酸酶在體外實驗中具有細胞毒性，但在體內實 驗中卻毫無毒性。該家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase?A)，由于受到 哺乳動物體內普遍存在的核糖核酸酶抑制劑(RI)的作用，不具備抗腫瘤作用。 而從牛精液中發現的天然二聚體形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，盡管與RNase?A 的氨基酸序列相似性高達80％，但是不受RI的抑制作用，在體內外實驗中均顯示 出強大的選擇性地抗腫瘤作用。BS-RNase不僅作用于腫瘤細胞，還具有胚胎毒性， 精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是來源于嗜酸性粒細胞的核糖核酸酶A 超家族成員，盡管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP 主要表現出強大的殺菌、殺寄生蟲的功能。從家雞(Gallus?gallus)白細胞中 分離到兩種核糖核酸酶RNases?A-1和A-2，二者具有81％氨基酸序列相同，二者 都與人血漿核糖核酸酶抑制劑(hRI)相互作用。RNases?A-2同時具有血管生成 活性和殺菌作用，RNases?A-1沒有這兩種活性。目前的研究發現，核糖核酸酶A 超家族成員是一組快速進化的蛋白家族，不同的物種中核糖核酸酶序列的微小差 異導致功能的顯著變化。

目前文獻報道的蛙類核糖核酸酶抗腫瘤的研究，僅局限于豹蛙、牛蛙和日本 稻田蛙。不同蛙物種核糖核酸酶的氨基酸序列不同，結構的差異導致功能不同。

在兩棲動物蛙屬中，最早被鑒定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt 等從R.pipiens卵中基于其抗腫瘤作用而分離的蛋白。Onconase完整氨基酸順序 的闡明，揭示出其屬于核糖核酸酶A超家族。另外三種核糖核酸酶從蛙的卵和肝 被鑒定：牛蛙Rana?catesbeiana(蛙卵rc-RNase，蛙肝rc-L1)日本稻田蛙Rana japonica(蛙卵rj-lec)。1998年Huang等首先分離出編碼蛙核糖核酸酶的cDNA， 發現mRNA僅在雌蛙的肝臟表達，最終合成的蛋白定位于蛙卵細胞中。2000年Liao 等從蛙卵黃顆粒提取物和肝中分離出5個編碼牛蛙R.catesbeiana核糖核酸酶的 cDNA序列(rc-01編碼rc-L1，rc-02，rc-03，rc-04，rc-06)，2000年Chen等 從R.pipiens中發現了性別特異性的細胞毒性核糖核酸酶(rp-rap)。2001年 Rosenberg等以牛蛙Rana?catesbeiana基因組DNA為模板，采用PCR得到了五個新 的蛙核糖核酸酶基因順序(rc-203，rc-204，rc-208，rc-212，rc-218)。表明 來源于蛙屬的核糖核酸酶基因通過正向選擇快速分化的方式進化，暗示了這個獨 特的蛋白家族可能具有新的生理功能。