[發明專利]中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列、構建方法及其氨基酸序列和用途

無效

• 申請號: 200910076365.1
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101775400A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 趙偉;陶鳳云
• 申請（專利權）人: 北京聯合大學生物化學工程學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/63;A61K38/46;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

1.一種中國林蛙功能基因Rd-RNase2，其特征在于，其核苷酸序列為序列表 中SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。

2.一種中國林蛙功能基因Rd-RNase2編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列為序列表中SEQ?ID?No.2所示。

3.根據權利要求1所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的構建方法， 其特征在于，其具體步驟為：提取出中國林蛙的基因組DNA，設計基因特異性引 物，進行PCR擴增，產物電泳；所述的基因特異性引物為序列表中SEQ?ID?No.3 和SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列，為正反引物對：

正向引物N275：TAT?TTG?CAG?TTG?TTT?TGA?GTC?TCA?C

反向引物C715：CTG?CTT?ATC?ACA?TCC?CTG?TTG?TC

從電泳膠中回收目標DNA片段，與質粒連接，轉移到細胞，提取質粒，PCR 初步鑒定目標基因后，測序。

4.根據權利要求3所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的構建方法， 其特征在于，所述PCR擴增的反應體系及參數：

基因組DNA、dNTPs、H₂O、10×Taq?Buffer、Taq?DNA?Polymerase和基因特 異性引物至總體積50μl，混合均勻；

擴增條件為：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35個循環，72℃延伸7min結束。

5.根據權利要求3所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的構建方法， 其特征在于，所述與質粒連接的具體步驟為：

(1)目標DNA片斷、載體、T4?DNA?Ligase、10×T4DNA?Ligase?Buffer至 總體積10μl；

(2)16℃連接10～12小時制備成連接好目標基因的載體；

(3)對步驟(2)連接好的樣品進行PCR檢測；連接產物1μl、dNTPs、10×Taq Buffer?5μl、Taq?DNA?Polymerase3U和質粒通用引物各10pmol，補無菌超純水 至總體積50μl，混合均勻；PCR擴增條件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35個 循環，72℃延伸7min結束；

(4)2.5％TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。

6.根據權利要求3所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的構建方法， 其特征在于，所述轉移到細胞的具體步驟為：

(1)將5μl目標基因與質粒連接的產物加入到100μl感受態細胞中，混 勻，冰浴30min；

(2)42℃水浴中熱激90s；取出后立即置于冰浴2min；

(3)加入500μl提前37℃預熱好的不含抗生素的LB培養基，37℃，150rpm 搖床培養45min；

(4)4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100μl涂轉化平板，涂 勻，干燥，倒置平板，37℃恒溫箱培養16h；

(5)挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養 基中，搖床37℃、180rpm培養12h。

7.根據權利要求3所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的構建方法， 其特征在于，所述提取質粒后PCR初步鑒定的PCR反應體系及參數為：

提取的重組質粒、dNTPs、10×Taq?Buffer、H₂O、Taq?DNA?Polymerase和引 物至總體積20μl，混合均勻；

PCR擴增條件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35個循環，72℃延伸7min結 束。

8.一種權利要求1所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2序列的擴增引物， 其特征在于，為序列表中SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列，為正 反引物。

9.權利要求2所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase2編碼的蛋白在制備治療 抗膠質腫瘤藥物中的應用。