[發(fā)明專利]人工合成豬生長激素基因及其表達純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910075520.8
• 申請日: 2009-09-21
• 公開（公告）號: CN101665788A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發(fā)明（設計）人: 柴寶峰;梁愛華;張振興;王偉;付月君;申泉;張志云
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/18
• 分類號: C12N15/18;C12N15/70;C12P21/02;C07K14/61;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 山西五維專利事務所（有限公司）
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發(fā)明涉及DNA重組技術，具體涉及編碼動物蛋白質的基因，更具體地說是一種人工 合成豬生長激素基因及其表達純化方法。

背景技術

我國是一個以食用豬肉為主的養(yǎng)豬大國，存欄數(shù)達到約5億頭之多，豬肉產量占世界產量 的55％以上。生豬“瘦肉精”的殘留在我國已經造成多起中毒事件，引起我國政府的關注。在 豬肉產量、品質和人類健康之間產生了生產者和消費者的矛盾。解決這一矛盾的有效途徑是 找到一種更為安全的生長調節(jié)劑，同時提高肉產品的品質和產量，使生產者和消費者能同時接 受。

豬生長激素(porcine?growth?hormone，PGH)是由豬腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一 肽鏈的蛋白質激素(190-191aa)。給豬注射外源PGH，能顯著提高豬的生長速率，降低單位飼 料的消耗量，促進肌肉的生長和減少組織的脂肪合成。最主要的是，PGH為蛋白質類激素制 品，不同于固醇類激素和人工合成的生長調節(jié)物質(如瘦肉精)，不在動物體內殘留，使生肉 產品更為安全，是一種生產者和消費者都能接受的生長調節(jié)劑。

PGH最早是從豬的機體組織中提取的，但從腦垂體提取PGH成本太高既花費時間和精力， 而且產量很有限，無法應用于大規(guī)模的生產。隨著科技的發(fā)展，人們開始通過微生物生產該 激素，Evock(Evock?et?al.，1991)等人首次用DNA重組技術在大腸桿菌(E.coli)中表達了重組 豬生長激素(rPGH)，其生物活性與由腦垂體提取的生長激素相同。目前為止，用大腸桿菌 表達系統(tǒng)得到的PGH多以包涵體形式存在，需包涵體的體外溶解并且蛋白質得到重新正確折 疊后才有活性；其次是PGH表達的表達量不夠高，經過變復性后，最后得到的純化的可溶性 PGH的產量偏低，不能用于工業(yè)大規(guī)模制備，因此，PGH的高成本限制了其在生產中的應用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種能在大腸桿菌中高效表達的人工合成豬生長激素基因及其表 達純化方法，該方法適合于豬生長激素的大規(guī)模制備。

本發(fā)明根據(jù)已報道(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的豬生長激素的氨基酸序列和大腸桿菌 偏愛密碼子的使用原則，設計編碼與豬體內氨基酸序列一致的豬生長激素的核苷酸序列，進 行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達，并利用酸堿度進行包涵體變復性，得到純化的可 溶性PGH。

本發(fā)明提供的一種人工合成豬生長激素基因，是序列表中SEQ?ID?NO1的核苷酸序列。 該人工合成豬生長激素基因長度為576bp的PGH基因序列，編碼191個氨基酸。

人工合成豬生長激素基因在大腸桿菌中的表達純化方法，包括如下步驟：

(1)構建含有人工合成的PGH基因的重組質粒pET-28a⁺-PGH；

(2)將重組質粒pET-28a⁺-PGH轉化至宿主細胞BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的工程 菌株；

(3)將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)，當工程菌培養(yǎng)液濃度OD₆₀₀達到0.6-0.8時， 加入0.5mmol/L?IPTG，37℃誘導表達6小時，得到高效表達的PGH包涵體；離心，棄上清， 清洗包涵體；

(4)逐滴加入pH為12的含有2mol/L尿素的100mmol/L?Tris緩沖液，溶解PGH包涵體；

(5)按0.1mL/min逐滴緩慢加入pH為8.5，含有50mmol/L?Tris、sucrose?5％、2mol/L?Urea 的復性緩沖液，4℃溫育2小時，13000rpm，4℃離心30min，取上清，得到可溶性的PGH；

(6)用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH純度鑒定，在280nm與215nm處出現(xiàn)一個單峰。10％SDS-PAGE分析經變復性實 驗及純化的目的蛋白質，結果顯示，本發(fā)明得到了電泳純的目的蛋白質；Western?blotting鑒 定結果進一步證實目的蛋白質及其純度。

與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

本發(fā)明使用了大腸桿菌偏愛密碼子設計了PGH的基因序列，在大腸桿菌中得到了高效 表達，比之前的方法在表達量上有很大提高，占到菌體總蛋白表達量的70％左右。