[發明專利]檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒的制備及其使用方法

有效

• 申請號: 200910073126.0
• 申請日: 2009-11-02
• 公開（公告）號: CN101696453A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 王君偉;李巖;高明春;馬波
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及反應試劑盒的制備及其使用方法。?

背景技術

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine?viral?diarrhea?virus，BVDV)又稱牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(Bovine?viral?diarrhea-mucosal?disease?virus，BVD-MDV)，為單股正鏈RNA病毒；牛接觸性傳染，癥狀主要表現為腹瀉，急、慢性粘膜病，持續性感染與免疫耐受，免疫抑制，母畜流產、死胎和畸胎等；該病主要發生于牛，還可感染豬、羊、鹿、駱駝及其它野生反芻動物。BVDV具有特征性的臨床癥狀較少，在實際生產中常常不易被診斷，加之本病的病死率不高，未能引起人們的足夠重視而忽視本病的存在，因此各牛場牛群缺乏系統的監測防制措施。BVDV對部分牛形成持續性感染，可嚴重影響牛的繁殖和生產，給養牛業造成了嚴重的經濟損失，阻礙了我國牛養殖業的健康發展，因此對牛群進行普查，檢測其感染情況，淘汰感染個體，成為本病防制的重要環節。所應用的檢測手段必須能夠有效的區分感染個體和非感染個體。?

目前，普通的血清學檢測方法不但無法區分自然感染個體和疫苗免疫個體，同時也無法檢出因長期持續性感染而無抗體產生的個體，傳統的病原學分離操作手段復雜、耗時無法應用于大規模篩查檢測。應用RT-PCR檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸靈敏度差，較難檢測持續性感染牛只。應用Real-time?PCR檢測，雖然靈敏度較高，但是Real-time?PCR檢測成本昂貴、需要專業設備及專業人員參與檢測，不適于現階段中國畜牧業發展狀況，較難大規模推廣使用。?

發明內容

本發明目的是為了解決現有檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法存在成本昂貴，需要專業設備及專業人員參與檢測且不適于現階段中國畜牧業發展狀況的問題，而提供檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒的制備及其使用方法。?

檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒的制備方法?按以下步驟實現：一、從基因數據庫中檢索所有牛病毒性腹瀉病毒的基因序列，通過Clustalw軟件分析找出特異性的保守靶DNA序列，然后利用Primer?Explorer?4軟件設計6條引物；二、根據所得的6條引物配制逆轉錄環介導等溫擴增反應液，即完成檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒的制備；其中步驟一中保守靶DNA序列為：TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG；?

步驟一中6條引物分別為：?

名稱????????????????????序列?

F3????5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’?

B3????5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’?

FIP???5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACAGTGGTGAGTT-3’?

BIP???5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTGAACGACC-3’?

FL????5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’?

BL????5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’；?

步驟二中逆轉錄環介導等溫擴增反應液為每20μl反應液由1.9μl的水、2.5μl的10×ThermoPol反應緩沖液、0.1μl的1M硫酸鎂、2μl的5M甜菜堿、4μl的10mM?dNTP、1μl的20×SYBR?GREEN?I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引物BIP、1μl的8U/μlBstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl核糖核酸酶抑制劑和1μl的10U/μl?AMV逆轉錄酶組成。?