[發明專利]檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒的制備及其使用方法

有效

• 申請號: 200910073126.0
• 申請日: 2009-11-02
• 公開（公告）號: CN101696453A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 王君偉;李巖;高明春;馬波
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

1.檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒 的制備方法，其特征在于檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫 擴增反應試劑盒的制備方法按以下步驟實現：一、從基因數據庫中檢 索所有牛病毒性腹瀉病毒的基因序列，通過Clustalw軟件分析找出特 異性的保守靶DNA序列，然后利用Primer?Explorer?4軟件設計6條 引物；二、根據所得的6條引物配制逆轉錄環介導等溫擴增反應液， 即完成檢測牛病毒性腹瀉病毒的逆轉錄環介導等溫擴增反應試劑盒 的制備；其中步驟一中保守靶DNA序列為： TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGC CATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAG TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGT CGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCA CGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGG GGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACA GCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAA TCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG；步驟一中 6條引物分別為：

名稱?????????????????????序列

F3???5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’

B3???5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’

FIP??5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACA

?????GTGGTGAGTT-3’

BIP??5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTG

?????AACGACC-3’

FL???5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’

BL??5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’；

步驟二中逆轉錄環介導等溫擴增反應液為每20μl反應液由1.9μl 的無核酸酶的水、2.5μl的10×ThermoPol反應緩沖液、0.1μl的1M硫 酸鎂、2μl的5M甜菜堿、4μl的10mM?dNTP、1μl的20×SYBR?GREEN? I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物 FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引 物BIP、1μl的8U/μl?BstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl核糖核酸酶抑 制劑和1μl的10U/μl?AMV逆轉錄酶組成。