[發明專利]建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法

無效

• 申請號: 200910072961.2
• 申請日: 2009-09-23
• 公開（公告）號: CN101654667A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 佟慧麗;高學軍;李慶章;林葉
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;G01N30/02;A01N1/02
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 崔東輝

(一)技術領域

本發明涉及生物細胞學，具體說就是一種建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法。

(二)背景技術

乳腺上皮細胞是泌乳的基本結構和功能單位，通過研究其內泌乳相關基因的表達，可以為揭示乳腺特異性表達基因如何被激活、泌乳重要功能基因如何起始和維持泌乳、調控乳汁組分提供理論依據。同時，有助于建立一種調控奶牛泌乳重要功能基因表達水平并顯著提高產奶量的乳腺生物調控技術。

原代培養是指從體內取出組織細胞開始培養到第一次進行傳代之前的時期，是一個特征性的必然生長階段。細胞或組織完成了從體內環境到體外環境的過渡和適應過程，恢復了分裂增殖與生長發育的能力。原代培養的乳腺上皮細胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，是制作乳腺生物反應器的靶細胞，體外培養的具有合成和分泌乳蛋白的乳腺上皮細胞能夠反映體內乳腺的分泌能力(徐曼妮等，2003)。來源于泌乳期乳腺的組織因其保持了自身的生物學功能，且具有半分化類上皮干細胞群的特征。因此對泌乳期乳腺上皮細胞體外培養的研究是構建細胞泌乳模型系統的基礎。

有泌乳功能的乳腺上皮細胞系既可以用來研究乳蛋白基因表達及乳汁分泌機制(Wheeler等，1995)，又可以作為研究干乳期細胞凋亡及乳腺退化的寶貴材料。同時還可以作為乳腺特異性表達載體的檢測系統，評價乳腺特異性表達載體的有效性及合理性(徐曼妮等，2003)，進一步作為乳腺生物反應器的細胞模型生產有價值的生物活性蛋白(李震，1997)。有泌乳功能的乳腺上皮細胞系是極具應用價值的研究工具。C127、T47D來源于小鼠、人等細胞系以及其他多數細胞系喪失了乳蛋白的分泌功能(胡艷秋等，2006)，不適合作為研究泌乳機制及檢測乳腺表達載體的細胞模型。目前，僅見KIM22、HC11、CID9等來源于小鼠、牛乳腺的細胞系具有乳蛋白合成能力(Katrina等，2000)，這些細胞系現在還只是用于實驗室研究，沒有形成商品化產品。

乳腺上皮細胞是高度分化的體細胞，其體外培養存在一定的困難，合適的培養體系對乳腺上皮細胞系的建立是十分重要的。對于奶牛乳腺上皮細胞的體外培養技術一直不成熟。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供一種奶牛泌乳機制研究的技術平臺，為乳蛋白基因表達調控機制的研究及乳腺表達載體的檢測提供有利條件的建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法。

本發明的目的是這樣實現的：所述的建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法，實驗方法步驟如下：

步驟一：奶牛乳腺上皮細胞的原代培養及鑒定

乳房中部消毒，按照常規手術切取少量乳腺組織塊，立即用D-Hanks液清洗組織塊并盡量剝離脂肪組織和結締組織，取乳腺腺泡組織部分剪成1mm³的小塊，以0.5cm的間距接種于預鋪膠原蛋白的細胞培養瓶中，鋪滿整瓶后，倒置培養于37℃的CO₂培養箱中3～4h，至組織塊牢固貼于膠原上時，輕輕將生長培養液加入培養瓶中，以覆蓋組織塊為準，隨后置于培養箱中繼續培養，每隔2d更換一次培養液，至細胞生長密度達80％～90％時，利用乳腺上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶敏感性的不同對細胞進行傳代培養以獲得純化的奶牛乳腺上皮細胞；采用常規的細胞免疫熒光染色方法對乳腺上皮細胞特異性的角蛋白18抗體進行熒光染色，進行激光共聚焦觀察以對乳腺上皮細胞進行鑒定；

步驟二：HPLC法測定乳糖的分泌情況

檢測樣品的處理：用流動相溶解不同濃度的乳糖標準樣品，用純水重懸不同處理組細胞，置于冰上用勻漿器機械破碎細胞，0.22μm濾膜過濾裂解液后用于乳糖的HPLC檢測；HPLC的檢測條件：色譜柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠，Φ4.6×150mm；柱溫，室溫；紫外檢測波長，195nm；流動相，5％乙睛，經過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣；流速，恒流0.6ml/min；進樣體積，10μl；分別以濃度為1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的乳糖標準品進行HPLC，以乳糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作乳糖標準曲線；細胞樣品與乳糖標準品采用完全相同的HPLC檢測條件；

步驟三：HPLC法測定β-酪蛋白的分泌情況