[發明專利]建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法

無效

• 申請號: 200910072961.2
• 申請日: 2009-09-23
• 公開（公告）號: CN101654667A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 佟慧麗;高學軍;李慶章;林葉
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;G01N30/02;A01N1/02
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 崔東輝

1.一種建立奶牛乳腺上皮細胞泌乳模型的方法，其特征在于：實驗方法步驟如下：

步驟一：奶牛乳腺上皮細胞的原代培養及鑒定

乳房中部消毒，按照常規手術切取少量乳腺組織塊，立即用D-Hanks液清洗組織塊并盡量剝離脂肪組織和結締組織，取乳腺腺泡組織部分剪成1mm³的小塊，以0.5cm的間距接種于預鋪膠原蛋白的細胞培養瓶中，鋪滿整瓶后，倒置培養于37℃的CO₂培養箱中3～4h，至組織塊牢固貼于膠原上時，輕輕將生長培養液加入培養瓶中，以覆蓋組織塊為準，隨后置于培養箱中繼續培養，每隔2d更換一次培養液，至細胞生長密度達80％～90％時，利用乳腺上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶敏感性的不同對細胞進行傳代培養以獲得純化的奶牛乳腺上皮細胞；采用常規的細胞免疫熒光染色方法對乳腺上皮細胞特異性的角蛋白18抗體進行熒光染色進行激光共聚焦觀察以對乳腺上皮細胞進行鑒定；

步驟二：HPLC法測定乳糖的分泌情況

檢測樣品的處理：用流動相溶解不同濃度的乳糖標準樣品，用純水重懸不同處理組細胞，置于冰上用勻漿器機械破碎細胞，0.22μm濾膜過濾裂解液后用于乳糖的HPLC檢測；HPLC的檢測條件：色譜柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠，Φ4.6×150mm；柱溫，室溫；紫外檢測波長，195nm；流動相，5％乙睛，經過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣；流速，恒流0.6ml/min；進樣體積，10μl；分別以濃度為1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的乳糖標準品進行HPLC，以乳糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作乳糖標準曲線；細胞樣品與乳糖標準品采用完全相同的HPLC檢測條件；

步驟三：HPLC法測定β-酪蛋白的分泌情況

檢測樣品的處理：用流動相溶解不同濃度的β-酪蛋白標準樣品，用純水重懸不同處理組細胞，置于冰上用勻漿器機械破碎細胞，0.22μm濾膜過濾裂解液后用于β-酪蛋白的HPLC檢測；HPLC的檢測條件：TSK凝膠柱，Φ7.8×300mm；柱溫，室溫；紫外檢測波長，280nm；流動相，超純水，經過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣；流速，恒流0.6ml/min；進樣體積，10μl；分別以濃度為1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的β-酪蛋白標準品進行HPLC，以乳糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作β-酪蛋白標準曲線；細胞樣品與β-酪蛋白標準品采用完全相同的HPLC檢測條件；

步驟四：細胞的凍存和復蘇

以20％DF12培養液、15％DMSO、HEPES和丙酮酸鈉作為凍存緩沖保護液，與FBS以1∶1的比例對乳腺上皮細胞進行凍存；具體操作方法為：棄去培養液，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化乳腺上皮細胞，加培養液終止消化，制成細胞懸液，收集到離心管中，1000r/min離心得細胞沉淀；用37℃預熱的FBS重懸細胞，以適量密度分裝于凍存管中，然后向每個凍存管中逐滴加入4℃預冷的凍存緩沖液，輕輕混勻；將寫有奶牛乳腺上皮細胞名稱、凍存日期及培養液類型的標簽貼于凍存管上；將凍存管封閉于保溫盒中置-80℃冰箱中，使細胞緩慢凍存，12-24h后將細胞投入液氮罐中長期保存；細胞的復蘇采用如下方法：取出保存細胞的凍存管，放入37℃～40℃水浴中之完全融化，一旦冰塊消失馬上將其取出；用75％乙醇擦洗凍存管外部以降低污染機會；吸出凍存管內容物于離心管中，緩慢加入新鮮培養液并輕輕混勻以清洗細胞；1000r/min，離心5min，得細胞沉淀，按照凍存前的細胞密度將細胞沉淀用新鮮培養液重懸接種。