[發明專利]一種小麥酯酶生物傳感器的制備方法

無效

• 申請號: 200910072241.6
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101576527A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 王振宇;焦巖
• 申請（專利權）人: 王振宇
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種小麥酯酶生物傳感器的制備方法。

背景技術

在當今世界農業發展過程中，盡管綠色和有機已經成為主題，可是現代農業很大程度上仍依賴于一些具有負作用的手段，如農藥的使用。有機磷類農藥具有品種多、藥效高、防治廣等優點，在我國農業生產上被大量使用。但是由于有機磷農藥及殘留物毒性較大，人長期攝入有機磷農藥可表現肝功能下降、血糖升高、白細胞吞噬功能減退等一系列病理變化，并有致畸、致癌、致突變的作用，嚴重者可導致中樞神經系統功能異常，因此有機磷農藥殘留已成為中國的主要食品安全性問題。解決農產品的關鍵問題主要依靠建立一種準確快速、簡單廉價的農藥殘留檢測技術，這已經成為食品安全和環境保護的當務之急。

生物傳感是指一類由生物敏感元件(酶、抗體、受體、細胞及組織器官等)、信號轉換器(電極、光纖、半導體、壓電晶體、及表面聲波、熱敏電阻等)和檢測器結合在一起來進行檢測的技術。它利用生物分子的催化作用或特異性來進行檢測，具有儀器體積小、便于攜帶；響應靈敏、快速；選擇性高、一般不需要對樣品進行預處理等優點，對于用于有機磷農藥的生物傳感檢測技術，最重要的生物敏感元件——酶的選擇。常用于檢測有機磷農藥檢測的酶類為動物酯酶和植物酯酶。但動物酯酶常常表現為保持期短，需冷凍低溫保存，這個缺點非常不適合現場快速檢測。而植物酯酶的優點恰恰是酶源易得，提取和保存較為方便，且酶源豐富，只需以一定比例的鹽溶液或緩沖液混合提取，之后離心獲得的上清液即可作為酯酶粗酶液用于檢測。

本發明制備的小麥酯酶生物傳感器，具有貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續及可控、工藝簡便、成本低廉等一系列優點。可應用于食品中有機磷農藥的快速檢測。

發明內容

為了解決現有酶生物傳感器儀器龐大，設備昂貴，手續復雜，需專業人員進行操作，因此不適于經常性的現場檢測等的問題，本發明提供了一種小麥酯酶生物傳感器的制備方法，能有效提高食品中有機磷農藥殘留測定的速度和精度，降低生物傳感器的成本。本發明中一種小麥酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于小麥酯酶生物傳感器的制備方法的步驟如下：一、小麥酯酶的提取：1、小麥經粉碎過40目篩后，準確稱量各10.0g，置于100mL錐形瓶中，分別加入蒸餾水，一定濃度的鹽溶液各30mL，搖床中震蕩提取，之后在4000r/min的速度離心20min，上清液過濾后測酶活，選擇出最佳提取溶劑。二、純化：1、脫鹽將硫酸銨分級鹽析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液裝入透析袋中，對蒸餾水透析48h，并用BaCl₂溶液檢測透析袋外溶液，直至透析袋外溶液與BaCl₂溶液無沉淀生成。2、使用SephadexG-100凝膠層析柱(2.5cm×60cm)，洗脫液為緩沖液，以一定的流速每管5ml進行收集，測定每管酶液比活力，檢測時做三個平行樣。三、小麥酯酶固定化：將去離子水與一定量的硅酸酯類化合物按照一定比例混合(R值)，加入25μLHCl，120mL甘油溶液(75％)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5％)，超聲30min。之后吸取80μL溶膠，加入150μL一定濃度的TritonX-100和162μL一定濃度的PEG-400溶液，漩渦振蕩20min即得到溶膠。將小麥酯酶以30mL/g的比例溶解于一定pH值的緩沖溶液中，磁力攪拌一定時間。吸取酶液加入到雜化溶膠中，旋渦振蕩10min。吸取100μL的混合溶膠均勻涂布于載玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麥酯酶。使用前，將其在pH?6.5的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡10min，再用O型圈將該酶膜固定在球型精密型酸度計玻璃電極表面，即制成小麥酯酶生物傳感器。

本發明中，在小麥酯酶固定化方法中，采用殼聚糖吸附-交聯法固定化小麥酯酶，克服了游離小麥酯酶穩定性差、易失活、小麥酯酶催化反應后與反應體系混在一起，無法回收和重復利用、生產成本偏高等缺點。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應特性的同時，還呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用。所制備的小麥酯酶生物傳感器，具有貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續及可控、工藝簡便、成本低廉等一系列優點。可應用于食品中有機磷農藥的快速檢測。

具體實施方式