[發明專利]天然抗菌劑鴨β-防御素9重組蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 200910071928.8
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101538583A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 馬得瑩;廖文燕;劉勝旺;韓宗璽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 劉 婭

(一)技術領域

本發明涉及一種生物材料的制備方法，具體涉及一種具有廣譜抗菌作用的生物材料的制備方法。

(二)背景技術

多年來，飼用抗生素被廣泛地用于降低畜禽類發病率和維持健康。然而，長期使用抗生素，尤其是人類常用抗生素會導致抗生素在畜產品中殘留及細菌耐藥性的產生，爾后通過食物鏈威脅人類健康。另外，抗生素的長期使用還會導致畜產品風味變差，而養殖業的發展在很大程度上依賴畜產品品質。因此，生產者們迫切需要一種既有效又有利于環保的新方法來控制畜禽疾病、改善畜產品品質。禽抗菌肽屬β-防御素類，為防御素三大亞類(α、β與θ)之一，為禽先天性免疫的重要組成部分，在禽的防御系統中發揮重要作用。由于抗菌肽為機體內產生的天然成分，具有廣譜抗菌、抗病毒和免疫增強作用，并且對機體無毒害、無殘留，因此，有望成為新的飼用添加劑服務于畜牧養殖業。然而，由于天然抗菌肽分子量小，在機體內含量很少，分離提純困難，故天然產量非常有限。化學合成與基因工程為獲得抗菌肽的主要手段。由于化學合成抗菌肽成本太高，因此，通過基因工程的方法在特定宿主內大量表達抗菌肽不失為一條有效的途徑。以抗菌肽的基因為基礎，選擇合適的表達宿主，可以通過基因重組的方法體外大量表達抗菌肽，為研制新型抗菌肽飼料添加劑開辟一條新的途徑。鴨β-防御素(AvBD)9重組蛋白為鴨體內天然存在的，含氨基酸殘基67個，具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。在體、內外具有廣譜抗菌活性和免疫促進作用，為本發明研究與應用提供了理論基礎。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供一中具有廣譜抗菌活性，并對溫度和酸堿度有很高的穩定性的鴨β-防御素9重組蛋白的制備方法。

本發明的目的是這樣實現的：

1.根據已發表的禽β防御素基因序列設計特異性引物，上游引物：5′-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3′，下游引物：5′-TTAGGAGCTAGGTGCCCATTTGCAGC-3′；

2.采用RT-PCR方法從鴨肝臟組織中擴增鴨AvBD9基因

并克隆到pMD-T載體上，經序列測定確定其基因序列為：

ATG?AGA?ATC?CTT?TTC?TTC?CTT?GTT?GCT?GTT?CTC?TTC?TTC?CTC?TTC?CAG?GCT

GCT?CCA?GCT?TAC?AGC?CAA?GAA?GAC?GCT?GAC?ACC?TTA?GCA?TGC?AGG?CAG?AGC

CAC?GGC?TCC?TGC?TCT?TTT?GTT?GCA?TGC?CGT?GCT?CCT?TCA?GTT?GAC?ATT?GGG

ACC?TGC?CGT?GGT?GGG?AAG?CTG?AAA?TGC?TGC?AAA?TGG?GCA?CCT?AGC?TCC?TAA

3.根據鴨AvBD9基因序列特點，用EcoRI和SalI雙酶切位點將鴨AvBD9基因亞克隆到原核表達載體pGEX-6p-1中，構建重組表達載體PGEX-6p-1-AvBD9，將其轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，Amp+篩選陽性克隆；

4.含陽性重組質粒的大腸桿菌BL21單個菌落在Amp+LB培養基中37℃振蕩培養，待OD值達到0.3-0.5時加入IPTG、終濃度為0.6mM進行誘導，誘導2-6小時內，每2小時分別采1ml菌樣，并分別于4℃、5000轉離心5分鐘，收獲細菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液體積的1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴2分鐘。

5.經親和層析柱純化回收鴨AvBD9重組蛋白。

誘導表達后的鴨AvBD9融合蛋白進行SDS-PAGE分析鑒定，取處理過的樣品15ul/孔，進行SDS-PAGE電泳(積層膠濃度為5％，分離膠為12％)。電泳后，經考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色。再通過薄層灰度掃描，確定蛋白質的表達量。獲得分子量30kD的特異表達帶，經蛋白質印跡分析，證明為鴨AvBD9特異蛋白。蛋白質的表達量為34％。

經親和層析柱純化回收鴨AvBD9重組蛋白在體外測定鴨AvBD9重組蛋白的抗菌作用與理化特性，研究發現鴨AvBD9重組蛋白的有益效果有：1)能抑殺多殺性巴氏桿菌、枯草芽胞桿菌、豬致病性璉球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌，2)對溫度和酸堿度有很高的穩定性，在-20～100℃處理30min或pH?3～12條件下處理30min，其殺金黃色葡萄球菌活性不變。