[發(fā)明專利]天然抗菌劑鴨β-防御素9重組蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910071928.8
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101538583A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬得瑩;廖文燕;劉勝旺;韓宗璽
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務(wù)所有限責(zé)任公司
• 代理人: 劉 婭

1、一種天然抗菌劑鴨β-防御素9重組蛋白的制備方法，其特征在于：

(1)根據(jù)已發(fā)表的禽β防御素基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5′-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3′，下游引物：5′-TTAGGAGCTAGGTGCCCATTTGCAGC-3′；

(2)采用RT-PCR方法從鴨肝臟組織中擴(kuò)增鴨AvBD9基因并克隆到pMD-T載體上，經(jīng)序列測定得如下基因序列：

ATG?AGA?ATC?CTT?TTC?TTC?CTT?GTT?GCT?GTT?CTC?TTC?TTC?CTC?TTC?CAG?GCT?GCTCCA?GCT?TAC?AGC?CAA?GAA?GAC?GCT?GAC?ACC?TTA?GCA?TGC?AGG?CAG?AGC?CACGGC?TCC?TGC?TCT?TTT?GTT?GCA?TGC?CGT?GCT?CCT?TCA?GTT?GAC?ATT?GGG?ACC?TGCCGT?GGT?GGG?AAG?CTG?AAA?TGC?TGC?AAA?TGG?GCA?CCT?AGC?TCC?TAA

(3)根據(jù)鴨AvBD9基因序列特點(diǎn)，用EcoRI和SalI雙酶切位點(diǎn)將鴨AvBD9基因亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-AvBD9，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，Amp+篩選陽性克隆；

(4)含陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21單個(gè)菌落在Amp+LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，待OD值達(dá)到0.3-0.5時(shí)加入IPTG、終濃度為0.6mM進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)2-6小時(shí)內(nèi)，每2小時(shí)分別采1ml菌樣，并分別于4℃、5000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收獲細(xì)菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液體積的1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴2分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定，取處理過的桿品15ul/孔，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，積層膠濃度為5％，分離膠為12％，電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色，再通過薄層灰度掃描，確定蛋白質(zhì)的表達(dá)量，獲得分子量30kD的特異表達(dá)帶，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析，證明為鴨AvBD9特異蛋白，蛋白質(zhì)的表達(dá)量為34％；

(5)經(jīng)親和層析柱純化回收鴨AvBD9重組蛋白，并在體外測定鴨AvBD9重組蛋白的抗菌作用與理化特性，研究發(fā)現(xiàn)鴨AvBD9重組蛋白：1)能抑殺多殺性巴氏桿菌、枯草芽胞桿菌、豬致病性璉球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌；2)對溫度和酸堿度有很高的穩(wěn)定性，在-20～100℃處理30min或pH?3～12條件下處理30min，其殺金黃色葡萄球菌活性不變。