[發明專利]天然抗菌劑鴨β-防御素2重組蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 200910071927.3
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101538582A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 馬得瑩;王瑞琴;劉勝旺;廖文燕;韓宗璽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 劉 婭

(一)技術領域

本發明涉及的是一種生物材料的制備方法，具體地說是一種具有廣譜抗菌作用的生物材料的制備方法。

(二)背景技術

禽類是眾多人畜共患病，如沙門氏菌、禽流感等病原的攜帶者，這些病原不僅是造成畜產品污染的原因之一，同時也嚴重威脅人、畜的健康。因此，保證禽類健康，最大潛力地發揮其先天性免疫功能，對維護人、畜健康，提高禽類的生產性能與禽產品安全性等都有重要意義。抗菌肽也稱為肽類抗生素或天然抗生素，是生物體產生的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。抗菌肽在自然界分布極為廣泛，廣泛地存在于細菌、植物、脊椎和無脊椎動物中，是天然免疫的重要效應分子。由于抗菌肽為機體內產生的天然成分，具有廣譜抗菌、抗病毒和免疫增強作用，并且對機體無毒害、無殘留，因此，有望成為新的飼用添加劑服務于畜牧養殖業。鴨AvBD2重組蛋白為鴨體內天然存在的，含氨基酸殘基65個，具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。在體、內外具有廣譜抗菌活性和免疫促進作用，為本發明研究與應用提供了理論基礎。

(三)發明內容

本法明的目的在于提供一中具有廣譜抗菌活性，并對溫度和酸堿度有很高的穩定性的鴨β-防御素2重組蛋白的制備方法。

本發明的目的是這樣實現的：

1.根據已發表的禽β-防御素基因序列設計特異性引物，上游引物：5`-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3`，下游引物：5`-CGCAATGGCAATTTATTC-3`；

2.采用RT-PCR方法從鴨胰腺組織中擴增鴨AvBD2基因并克隆到pMD-T載體上，經序列測定確定其基因序列為：

atgaggatcc?tttacctgct?cttctctgtc?cttttcctgg?tgctccaggt?ttctccagga?ttgtctttgc?cccagcggga?catgtttctc

tgtaggaaag?gctcctgcca?cttcggaaga?tgtcccatcc?acctgatcag?agttggaagc?tgctttgggt?tccgctcctg

ctgcaaatcg?ccatgggatg?tataa

3.根據鴨AvBD2基因序列特點，用EcoRI和SalI雙酶切位點將鴨AvBD2基因亞克隆到原核表達載體pGEX-6p-1中，構建重組表達載體pGEX-6p-1-AvBD2，將其轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，Amp+篩選陽性克隆；

4.含陽性重組質粒的大腸桿菌BL21單個菌落在Amp+LB培養基中37℃振蕩培養，待OD值達到0.3-0.5時加入IPTG、終濃度為0.6mM進行誘導，誘導2-7小時內，每小時分別采1ml菌樣，并分別于4℃、5000轉離心5分鐘，收獲細菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液體積的1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴2分鐘。

5.經親和層析柱純化回收鴨AvBD2重組蛋白。

誘導表達后的鴨AvBD2融合蛋白進行SDS-PAGE分析鑒定，取處理過的樣品15ul/孔，進行SDS-PAGE電泳(積層膠濃度為5％，分離膠為12％)。電泳后，經考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色。再通過薄層灰度掃描，確定蛋白質的表達量。獲得分子量30kD的特異表達帶，經蛋白質印跡分析，證明為鴨AvBD2特異蛋白。蛋白質的表達量為40％。

經親和層析柱純化回收鴨AvBD2重組蛋白在體外測定鴨AvBD2重組蛋白的抗菌作用與理化特性，研究發現鴨AvBD2重組蛋白的有益效果有：1)能抑殺多殺性巴氏桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌，2)對溫度和酸堿度有很高的穩定性，在-20～100℃處理30min或pH?3～12條件下處理30min，其殺菌活性不變。

本發明采用分子生物學技術，從鴨體內克隆到鴨AvBD2基因，選用合適的表達宿主在體外表達鴨AvBD2重組蛋白。進一步研究發現，鴨AvBD2重組蛋白具有廣譜抗菌活性，并對溫度和酸堿度有很高的穩定性。

(四)附圖說明

圖1為采用RT-PCR方法從鴨胰腺組織中擴增鴨AvBD2基因表達電泳圖照片，圖中DLMarker2000：從上到下依次為：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，1：鴨AvBD2，M：Marker；